112.247.67.26：以“'''DNA重组技术'''(DNA recombinant technology)，将不同来源的DNA片段共价整合到有复制功能的DNA中去的技术。又称分子克隆。该...”为内容创建页面

2014-02-05T09:41:18Z

以“'''DNA重组技术'''(DNA recombinant technology)，将不同来源的DNA片段共价整合到有复制功能的DNA中去的技术。又称分子克隆。该...”为内容创建页面

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'''DNA重组技术'''(DNA recombinant technology)，将不同来源的[[DNA]]片段共价整合到有复制功能的DNA中去的技术。又称[[分子克隆]]。该[[重组]]的 DNA[[分子]]可在寄主[[细胞]]中复制、[[扩增]]，并[[转录]]表达出与该外源性DNA相应的[[信使RNA]]或[[蛋白质]]。

[[DNA重组技术]]的主要步骤是：

① 选择并分离能携带外源性 DNA的载体。常用的DNA载体有[[细菌]][[质粒]]([[染色体]]外DNA)，或[[噬菌体]]DNA，如[[大肠杆菌]]质粒CoLEI及pBR322;λ噬菌体及M13噬菌体DNA等，它们都能插入(或整合)一定长度的外源性DNA片段，并能在寄主细胞中自我复制。

② 以[[限制性内切酶]]特异性水解打开载体的双链DNA，使之具有特定的序列末端。不同的限制性内切酶能识别并水解打断双链 DNA中的特定序列处，如限制性内切酶ECoRI能识别下列结构并加以水解切断。

  　   （打断处）

  　   ↓

   ………GAATTC………

………CTTAAG………

    　 ↑

   　（打断处）

③ 制备拟整合入质粒中的外源性DNA片段(即“目的[[基因]]”)，使其末端与上述经限制性内切酶切割后的载体DNA末端，具有互补的序列结构，便于粘合。

④ 将该具有互补序列结构的外源性DNA片段，通过[[连接酶]]整合入载体DNA中。若载体是质粒，则在整合入外源性DNA片段后，仍重新连接成环状质粒。

⑤ 将此[[重组DNA]]引入寄主细胞中，使其复制和扩增。常用的寄主细胞为大肠杆菌及[[酵母]]，近已发展到用[[高等植物]]细胞及哺乳动物细胞。这类寄主细胞业经[[变异]]处理，使之丧失降解外源性DNA的能力。将载体DNA往[[氯化钙]]及[[磷酸钠]]处理，使成DNA-[[磷酸钙]]微粒，就易被寄主细胞内吞而[[转染]]之。亦有用核内[[注射法]]或高压电膜击穿法以引入载体DNA者。

⑥ 通过一定的方法筛选能复制此重组 DNA的细胞或[[菌落]]。筛选方法的基础是质粒上含有[[抗药性]]基因，或利用该菌对某营养素的依赖[[表型]]。将该筛选出来的[[细胞株]][[克隆]]繁殖，即能不断复制扩增大量的该外源性重组DNA。

1972年，D.A.杰克逊成功地从两种不同[[生物]]来源的DNA（[[病毒]]SV40分子及λ噬菌体分子），合成了第一个重组DNA分子。1973年S.科恩等成功地使重组DNA分子在寄主细胞内获得表达。这为今后体外大规模生产某特种蛋白质的[[基因工程]]的发展奠定了基础，使不少人体中含量极微而十分重要的蛋白质(如某些[[激素]]和因子)的[[生物合成]]，能体外实现，这对医学和[[生物学]]的发展具有划时代的意义。如[[人胰岛素]]、[[干扰素]]、[[乙型肝炎疫苗]]等已可用重组 DNA技术大规模生产。许多[[临床诊断]]用的特异性[[基因探针]]，也可通过DNA重组技术的扩增而获得，从而使很多[[遗传性疾病]](如 [[β-地中海贫血]]等)及[[乙型肝炎]]等的诊断水平前进了一大步。试用重组DNA进行“[[基因治疗]]”，将能补偿某些病人对该基因的缺失，此项研究在[[转基因动物]]中已实验成功，应用前景诱人。

DNA重组技术 - 版本历史

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