112.247.109.102：以“质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒...”为内容创建页面

2014-01-26T15:12:40Z

以“质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒...”为内容创建页面

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[[质粒]]具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用[[限制性内切酶]]切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到[[重组质粒]]转化[[细菌]],即可完成。但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体[[分子]]是较为困难的。通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去[[磷酸]]化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别[[重组子]]和非重组子。　　
==反应策略==

===带有非互补突出端的片段===
外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：

1、带有非互补突出端的片段用两种不同的限制性内切酶进行[[消化]]可以产生带有非互补的[[粘性末端]],这也是最容易克隆的DNA片段，一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同[[限制酶]]的识别序列组成的多克隆[[位点]]，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的[[限制酶切]]位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR[[扩增]]时，在DNA片段两端人为加上不同[[酶切位点]]以便与载体相连。　　
===带有相同的粘性末端===
2、带有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成[[寡聚]]物, 而且正反两种连接方向都可能有。所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度, 以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。还可将载体DNA的5'[[磷酸基]]团用碱性磷[[酸酯]]酶去掉, 最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。带5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入E. coli[[受体菌]]后的扩增过程中缺口可自动修复。　　
===带有平末端===
3、带有平末端是由产生平末端的限制酶或[[核酸外切酶]]消化产生，或由DNA[[聚合酶]]补平所致。由于平端的连接效率[[比粘]]性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA[[连接酶]]的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的[[聚乙二醇]](PEG 8000)以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。　　
===特殊情况下===
外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配,则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头(linker)或[[衔接头]](adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3'凹端,使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。

[[分类:生物化学]][[分类:生物]][[分类:化学]][[分类:分子生物学]][[分类:基因]]

重组质粒 - 版本历史

112.247.109.102：以“质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒...”为内容创建页面