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2014-01-26T04:46:21Z

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{{百科小图片|bkgie.jpg|[[转染]]}}转染（transfection）采用与[[质粒]]DNA转化[[受体]][[细胞]]相似的方法，即[[宿主]]菌先经过CaCl2，[[电穿孔]]等处理成[[感受态]][[细菌]]，再将[[重组]][[噬菌体]]DNA直接导入受体细胞，进入感受态细菌的噬菌体DNA可以同样复制和繁殖，这种方式称为转染。转染是转化的一种特殊形式。

==简介==
转染(transfection)指[[真核细胞]]由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。{{百科小图片|bkgif.jpg|[[细胞化学]]转染}}常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主[[染色体]]中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于[[启动子]]和其它调控元件的分析。一般来说，[[超螺旋]]质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如[[荧光蛋白]]，β[[半乳糖苷酶]]等来帮助检测。后者也称稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基[[转移酶]]（APH；[[新霉素抗性基因]]），[[潮霉素B]][[磷酸转移酶]]（HPH），[[胸苷激酶]]（TK）等反复筛选，得到稳定转染的[[同源]][[细胞系]]。

转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染[[试剂]]比例，细胞数量，培养及检测时间等。　　
==分类==

===[[化学]]转染法===
包括：1.DEAE-[[葡聚糖]]法，2.[[磷酸钙]]法，3.人工[[脂质体]]法。DEAE葡聚是最早应用哺乳动物细胞转染试剂之一，DEAE-葡聚糖是阳离子多聚物，它与带负电的[[核酸]]结合后接近[[细胞膜]]而被摄取，用DEAE-葡聚糖转染{{百科小图片|bkgig.jpg|转染示意图}}成功地用用于瞬时表达的研究，但用于稳定转染却不是十分可靠。磷酸钙法是[[磷酸钙共沉淀]]转染法，因为试剂易取得，价格便宜而被广泛用于瞬时转染和稳定转染的研究，先将DNA和[[氯化钙]]混合，然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀，最后把含有沉淀的[[混悬液]]加到培养的细胞上，通过细胞[[胞膜]]的[[内吞作用]]摄入DNA。磷酸钙似乎还通过抑制[[血清]]中和细胞内的[[核酸酶]]活性而保护外源DNA免受降解.人工脂质体法采用阳离子脂质体，具有较高的转染效率，不但可以转染其他化学方法不易转染的细胞系，而且还能转染从[[寡核苷酸]]到人工[[酵母]]染色体不同长度的DNA，以及RNA,和[[蛋白质]].此外，脂质体体外转染同时适用于瞬时表达和稳定表达，与以往不同的是脂质体还可以介导DNA和RNA转入动物和人的体内用于[[基因治疗]]。人工合成的阳离子脂质体和带负电荷的核酸结合后形成[[复合物]]，当复合物接近细胞膜时被内吞成为内体进入[[细胞质]]，随后DNA复合物被释放进入[[细胞核]]内，至于DNA是如何穿过[[核膜]]的，其机理目前还不十分清楚.　　
===[[物理]]方法===
包括：①[[显微注射]]②电穿孔③[[基因枪]]等，显微注射虽然费力，但是非常有效的将核酸导入细胞或细胞核的方法。这种方法常用来制备[[转基因动物]]，但却不适用于需要大量转染细胞的研究。电穿孔法常用来转染如植物[[原生质体]]这样的常规方法不容易转染的细胞。电穿孔靠脉冲电流在细胞膜上打孔而将核酸导入细胞内。导入的效率与脉冲的强度和持续时间有关系，基因枪依靠携带了核酸的高速粒子而将核酸导入细胞内，这种方法适用于培养的细胞核在体的细胞.　　
==细胞转染实验==

===实验目的===
学习和掌握[[外源基因]]导入真核细胞的主要方法—脂质体介导的转染。了解外源基因进入的一般性方法，观{{百科小图片|bkgih.jpg|[[基因]]转染示意图}}测外源[[蛋白]]的表达（绿色荧光蛋白），为[[染色]]准备实验材料。　　
===实验原理===
外源基因进入细胞主要有四种方法：[[电击]]法、磷酸钙法和脂质体介导法和[[病毒]]介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的[[穿孔]]让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的[[病毒感染]]细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。

利用脂质体转染法最重要的就是防止其[[毒性]]，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和[[培养基]]中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。

本次实验采用的脂质体是promega公司的TransFast脂质体试剂，它是一种阳离子脂质体和中性脂质体的混合物，是对于本次实验中采用的293T细胞优化的转染试剂。"　　
===实验材料与器材===
（1）材料

293T细胞、MyoD表达质粒和EGFP表达质粒、DMEM培养基、[[链霉素]]/[[青霉素]]（双抗）、FCS（小牛血清）、PBS（[[磷酸盐]]缓冲溶液）、[[胰酶]]/EDTA消化液、转染试剂（TransFast）

（2）器材

20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip头[[酒精灯]]、废液缸、血球计数板、涡旋[[振荡器]]、[[恒温]]水浴箱、台式[[离心机]]、35mm[[培养皿]]、转染管、15ml[[离心管]]、观察用[[倒置显微镜]][[荧光显微镜]]和CCD　　
===实验步骤===
细胞[[传代]]

(1)试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需[[高压灭菌]]），[[酒精]][[棉球]]，废液缸，[[试管架]]，微量移液器，[[记号笔]]，培养皿，离心管。

(2)弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。

(3)用Tip头加入1mlTrypsin液，[[消化]]1分钟（37。C，5%CO2)。用手轻拍[[培养瓶]]壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。

(4)加入1ml的含血清培养基终止反应。

(5)用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。

(6)将[[培养液]]装入离心管中，1000rpm离心5min。

(7)用培养液重悬细胞，[[细胞计数]]后选择0.8X106个细胞加入一个mm培养皿。

(8)将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。

(9)将培养皿转入CO2[[培养箱]]中培养，第二天转染。

细胞转染

1）转染试剂的准备

A.将400ul[[去核]]酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。

B.震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡，。

2）选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的[[无血清培养基]]。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。

5）将混合液在室温放置10-15分钟。

6)吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。

7）加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。

8）到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。

第二次细胞传代

1）在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。

2）再次进行细胞传代，按照[[免疫]]染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新粉入培养皿中。

3）在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。　　
==研究进展==

===转染技术===
国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术，以其适用宿主范围广，操作简便，对[[细胞毒性]]小，转染效{{百科小图片|bkgii.jpg|转染试剂}}率高受到研究者们的青睐。其中树枝状聚合物（Dendrimers）和[[聚乙烯]][[亚胺]]（Polyethylenimine，PEI）的转染性能最佳，但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性，且其合成工艺复杂。聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子，即每“第三个原子都是质子化的[[氨基氮]]原子，使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”(protonsponge)体。这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于[[脂质]]聚酰胺，经进一步的改性后，其转染性能好于树枝状聚合物，而且它的细胞毒性低。大量实验证明，PEI是非常有希望的基因治疗载体。目前在设计更复杂的基因载体时，PEI经常做为核心组成成分。　　
===转染效率===
线型PEI（LinePEI,LPEI）与其[[衍生物]]用作基因转染载体的研究比分枝状PEI（BranchedPEI,BPEI）要早一些，过去的研究认为在不考虑具体条件，LPEI/DNA转染复合物的细胞毒性较低，有利于[[细胞定位]]，因此与BPEI相比应该转染效率高一些。但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的转染复合物，从而提高转染效率，但同时细胞毒性也增大。超高分枝的、较柔性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基，在染实验中发现这种PEI的毒性低，但转染效率却较高。

GenEscort是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI与各种含有[[生理]]条件下可降解键的交联剂交联，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝结构使得其具有较高的正电性，因此易于高效地包裹各种DNA、RNA[[分子]]及质粒形成小的纳米颗粒，从而提高转染效率，当所形成复合物进入细胞以后，其中所含的生理条件下可降解的化学键在细胞内水解，使交联聚合物分解为无细胞毒性的小分子PEI，这样结构的转染试剂在体外应用可以获得高的转染效率和低的细胞毒性，其可降解性对体内应用也具有重要的意义。

[[分类:生物化学]][[分类:生物]][[分类:化学]][[分类:分子生物学]][[分类:遗传学]]

转染 - 版本历史

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