112.247.67.26：以“（PFGE，Pulsed Field Gel Electrophoresis）是一种分离大分子DNA的方法。在普通的凝胶电泳中，大的DNA分子（>10kb）移动速度...”为内容创建页面

2014-02-06T11:03:30Z

以“（PFGE，Pulsed Field Gel Electrophoresis）是一种分离大分子DNA的方法。在普通的凝胶电泳中，大的DNA分子（>10kb）移动速度...”为内容创建页面

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（PFGE，Pulsed Field Gel Electrophoresis）是一[[种分离]]大分子DNA的方法。在普通的[[凝胶电泳]]中，大的DNA[[分子]]（>10kb）移动速度接近，很难分离形成足以区分的条带。在[[脉冲场凝胶电泳]]中，电场不断在两种方向（有一定夹角，而不是相反的两个方向）变动。DNA分子带有负电荷，会朝正极移动。相对较小的分子在电场转换后可以较快转变移动方向，而较大的分子在[[凝胶]]中转向较为困难。因此小分子向前移动的速度比大分子快。脉冲场凝胶电泳可以用来分离大小从10kb到10Mb的DNA分子。　　
==高分子量DNA[[琼脂糖]]凝胶块制备和加工==
1．收集10ml全血，加入30ml[[细胞]]裂解液。置冰浴中至少20min直至[[红细胞]]完全溶解。

2．2000r/min离心10min，移去红色[[上清液]]，再次用细胞裂解液洗涤细胞，然后用PBS重悬细胞。

3．稀释单细胞悬液并取一小份用Neubauer腔计数细胞。

4．用PBS重悬细胞，以达到40μl PBS中含1百万个细胞比例（1百万个倍体哺乳动物大约含有[[基因组]]DNA 10μg）

5．用PBS配制2％浓度低熔点琼脂糖溶液并保持在50℃。

6．将等体积（各1ml）细胞悬液与琼脂糖溶液于室温下混匀，立即倒入凝胶块模具中。

7．静置20min让琼脂糖固化，用[[无菌]]塑料杯（通常用作划菌）将凝胶块自模具中取出并置入[[蛋白酶]][[缓冲液]]中，加入2mg/ml的蛋白酶K。

8．将带有凝胶块的蛋白酶K缓冲液于50℃保持2～3天。每个盛有50ml蛋白酶缓冲液的Falcon管可容纳多达100个凝胶块。

9．蛋白酶K[[消化]]后，可将凝胶块保留在此缓冲液或0.5mol/L EDTA溶液中保存于4℃。

10．此外，继续将凝胶块用[[高压]][[消毒]]过的TE缓冲液冲洗数遍的步骤。

11．将凝胶块放入装有TE及0.04mg/ml PMSF溶液的Falcon[[试管]]中，灭活残留的蛋白酶K。

12．室温下用TE溶液漂洗凝胶块数次，将凝胶块放入另一干净的试管，可直接用于酶切反应或用0.5mol/L

EDTA，（pH8.0）4℃保存凝胶块。

13．若用EDTA保存凝胶块，取出后应用TE溶液室温下漂洗30 min×2次。　　
==大小标准物的制备==

===λ[[多联体]]===
1．以TE缓冲液悬浮λ多联体（Boehringer MA宝灵曼公司产品），浓度为4μg/40μl。

2．用等体积TE配制的2％低熔点琼脂糖（温度保持在45℃）混匀。

3．移去混合液注入预冷的凝胶块模具中。

4．室温下用TE及100 mmol/L NaCl溶液[[温育]]2天。　　
===[[酵母]][[染色体]]===
1．从YPD（酵母提取物，[[蛋白胨]]和[[葡萄糖]]）[[培养基]]瓶皿中挑选单一克隆加入10ml

YPD预培养的肉汤中，30℃下剧烈震荡生长24小时，然后加入200ml YPD肉汤，剧烈振荡24～48h（产量大约100块）。

2．4000×g转速，离心10min，然后用50mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)溶液悬浮。

3．仍以4000×g转速离心10min，再用SCE[1 mol/L [[山梨醇]]，0.1mol/L枸椽酸钠，pH5.8及10 mmol/L

EDTA (pH7.5)]溶液重悬。

4．取稀释后的细胞悬液用Neubauer腔计数。

5．溶液短暂离心后，再用SCE重悬细胞，使40μl SCE溶液中含5×107个细胞（相当于80μl体积的模块中含有5×107个细胞）。

6．溶液与0.1mg/ml酵母扣[[糖酶]]100T和100mmol/Lβ-[[巯基]][[乙醇]]混匀，37℃保温15～30min。

7．细胞悬液与等体积的SCE配制的2％低熔点琼脂糖凝胶混匀，保持在50℃。

8．将混合物移注入预冷的凝胶块模具中。

9．凝胶块用含10 mmol/L[[二硫苏糖醇]]的SCE溶液37℃下振荡温育1～2小时。

10．将凝胶块移入蛋白酶缓冲液中，加入2mg/ml蛋白酶K，50℃温育48h。

11．用50 mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)溶液洗涤凝胶块3次，每次min。

12．凝胶块可用此混合液于4℃保存或不用漂洗直接装载入凝胶中。　　
==琼脂糖凝胶块中DNA的[[限制性内切酶]]消化==
1．应使用消毒溶液及戴无菌手套以免DNA降解。

2．在Falcon试管中用1×TE溶液漂洗凝胶块20min 3次，以去除EDTA。

3．混合：[[酶反应]]缓冲液（高、中或低盐缓冲液），100

mmol/L亚[[精胺]]（只用于高盐缓冲液状态），10～20单位的[[内切酶]]。20单位的内切酶就足以过夜完全消化10μg DNA。

4．设立一个除内切酶成分外含有混合物各组分的阴性对照，以检查是否有非特异性DNA降解。

5．将琼脂糖凝胶块加入反应混合溶液中：通常用消毒过的手术刀或套环将凝胶块移入。

6．若两种内切酶所需缓冲液条件一致，可以同时或先后用两种不同的酶进行消化（先用低盐缓冲液的酶消化，再调整盐浓度）。倘若首次消化的酶要求50℃条件，在第二个酶消化时要换缓冲液。

7．若要进行部分消化，则首先在同一温度和反应时间用1：10稀释的酶进行尝试。　　
==凝胶电泳==
1．将0.8％的琼脂糖在0.25×TBE中熔化后冷却至50～60℃，立即注入凝胶框架中，并插入梳子。

2．凝胶固化后小心地拔出齿梳，用2把无菌手术刀将DNA凝胶块上样。若用不同内切酶消化凝胶块，则取不同样品时应将[[手术刀片]]烧灼后冷却。将DNA大小标志物上样至凝胶的两旁。

3．用1％液态低熔点琼脂糖凝胶（0.25×TBE配制）密封狭槽。

4．若有气泡存在，用[[注射器]]驱赶气泡。

5．一旦密封的低熔点琼脂糖已固化（大约10min），可将凝胶搁入腔室，并用电泳缓冲液覆盖过胶面。

6．应设定合适的电压及转换时间（参考《分子医学技术》84页表8.1）并开始电泳。两个不同电泳方向的电流应相等。

7．电泳结束后，凝胶用0.25×TBE配制成的EB（0.4μg/ml）[[染色]]。

8．用泵自槽中排除缓冲液，续以双蒸水冲洗电泳槽。

9．凝胶[[成像]]：DNA在曝光的过程中可能会形成缺口。

10．用0.25mol/L HCl漂洗凝胶30min，让DNA[[脱嘌呤]]，并有利于转移。

11．凝胶用碱（变性溶液中）变性20min，两次，续以中性溶液1～5min。

12．采用标准Southern印迹方案将DNA转印至[[尼龙]]膜上。一般来说，印迹PFGE凝胶的时间较普通凝胶印迹时间长（约48h）。

脉冲场凝胶电泳 - 版本历史

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