2014年3月12日 (三) 14:07 Admin

2014-03-12T14:07:42Z

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{{百科小图片|bka1y.jpg|PCR流程}}　　
'''聚合酶链式反应'''(Polymerase Chain Reaction)，简称'''PCR'''，是一种[[分子]][[生物学]]技术，用于放大特定的[[DNA]]片段。可看作生物体外的特殊[[DNA]]复制。
　
{{百科小图片|PCR技术.gif|PCR技术}}
==PCR原理==
DNA的[[半保留复制]]是生物进化和[[传代]]的重要途径。双链DNA在多种[[酶]]的作用下可以变性解链成单链，在[[DNA聚合酶]]的参与下，根据[[碱基]]互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以[[复性]]成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计[[引物]]，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

但是，[[DNA聚合酶]]在高温时会[[失活]]，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。

发现耐热[[DNA聚合酶]]--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的[[寡核苷酸]]引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR[[扩增]]形成的双链DNA[[解离]]，使之成为[[单链]]，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板--引物[[结合物]]在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的[[基因扩增]]放大几百万倍。　　
　　
{{百科小图片|PCR原理.jpg|PCR原理}}
==PCR步骤==
<b>标准的PCR过程分为三步</b>：

1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA

2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。

每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。如图所示：

现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq[[酶活性]]不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。　　
　　
==PCR反应特点==
（1）特异性强

PCR反应的特异性决定因素为：

①引物与模板DNA特异正确的结合；

②[[碱基配对]]原则；

③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；

④靶基因的特异性与保守性。

其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶[[基因区]]，其特异性程度就更高。

（2）灵敏度高

PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(μg=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个[[靶细胞]]；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。

（3）简便、快速

PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用[[同位素]]，无[[放射性]]污染、易推广。

（4）对标本的纯度要求低

不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。　　
==PCR的循环参数==
1、预变性（Initial denaturation）：模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考[[试剂]]说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。　

2、循环中的变性步骤：循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间。变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。

3、引物退火（Primer annealing）：退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。

4、引物延伸：引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略。延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其[[衍生物]]的衍生设定为1min/kbp。　

5、循环数：大多数PCR含25-40循环，过多易产生非特异扩增。

6、最后延伸：在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。

{{百科小图片|PCR仪器.jpg|PCR仪器}}　　
==PCR学习视频==
<videoflash>http://v.youku.com/v_show/id_XNTI0NjU5Njg=.html</videoflash>
==参看==
*[[DNA]]
*[[基因]]
*[[DNA聚合酶]]

[[分类:生物]][[分类:生物学]]
[[分类:医学视频]]

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 {{百科小图片|PCR仪器.jpg|PCR仪器}}
 ==PCR学习视频==
-<videoflash>http://v.youku.com/v_show/id_XNTI0NjU5Njg=.html</videoflash>
 ==参看==
 *[[DNA]]

聚合酶链式反应 - 版本历史

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