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2014-01-25T23:05:53Z

以“目的探讨匹那地尔对高钾停搏液处理后大鼠离体心肌细胞内游离钙与舒缩功能的影响。方法SD大鼠心室肌细胞酶解...”为内容创建页面

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目的探讨匹那地尔对高钾停搏液处理后[[大鼠]]离体[[心肌细胞]]内游离钙与舒缩功能的影响。方法SD大鼠[[心室]][[肌细胞]]酶解分离静息1～2h后随机分为对照组，高钾停搏液组，匹那地尔强化组，[[格列苯脲]][[拮抗]]组。四组[[细胞]]均在24℃下保存2h,此后对细胞进行复氧、复灌20min并测定细胞收缩、［Ca2+］i瞬态、[[肌浆网]]内贮钙释放功能。结果匹那地尔使心肌细胞在[[缺血]]再灌注中收缩功能，［Ca2+］i瞬态，肌浆网内贮钙释放能力明显优于高钾停搏液组（P＜0.01〉及细胞内钙释放后的钙峰回落时间明显短于高钾停搏液组（P＜0.01〉。结论匹那地尔通过维持良好的肌浆网和[[细胞膜]]Na+/Ca2+[[交换体]]功能来调节钙瞬态变化，减少细胞内钙超载从而改善心肌细胞缺血后收缩功能，同时避免了高钾停搏液的负面效应。

【关键词】[[心脏停搏液]]；心肌细胞；大鼠

虽然高钾停搏液能起到较好的[[心肌保护]]作用，但仍有证据表明暴露在这种溶液后的[[心肌]]功能有一定程度的损害，如心肌收缩力下降，细胞内钙超载［1］，可能与肌浆网钙释放及Na+/Ca2+交换体的钙外排减少有关［2］。激活ATP敏感钾通道（KATP）可减少L-型钙通道的钙内流，促进Na+/Ca2+交换体的钙外排，使细胞免于损伤和顿抑［3，4］。本研究目的在于用单细胞收缩、细胞内钙［Ca2+］i瞬态、[[内质网]]钙释放等功能检测来探讨KATP非特异性开放剂（匹那地尔）对高钾停搏液处理后大鼠离体心肌细胞内游离钙与舒缩功能的影响。

1材料与方法

1.1药物与[[试剂]]匹那地尔（Pinacidil批号60K1387），格列苯脲(Glibenclamide批号58H0570)，Fura-2/Am(批号108964-32-5),均购自美国Sigma公司。

无钙Tyrode氏液配制（mmol/L）：NaCl100、KCl10、KH2PO41.2、MgSO4.7H2O5、[[葡萄糖]]20、[[牛磺酸]]20，3-(N-[[吗啉]]代)[[丙磺酸]]10。冲100%O2用KOH(5mol/L)调至pH7.20。K-H液（mmol/L）：NaCl118.5、NaHCO325、KCl4.75、MgSO41.2,KH2PO41.2、CaCl22.5、葡萄糖11.1。

1.2[[左心室]]单细胞制备成年SD大鼠20只，由浙江大学医学院动物实验室提供。雌雄不拘，体重232g～252g，断头处死后，迅速开胸取出[[心脏]]，置于4℃[[氧饱和]]Tyrode氏液中洗净[[血液]]后固定于Langendorff灌流装置上用95％O2＋5％CO2[[饱和]]的K-H液[[恒温]]（37℃）恒流行[[主动脉]]逆行灌注，流速10ml/min。酶解法分离心室肌细胞［5］。先以无钙Tyrode氏液灌流5min，再以含I型[[胶原酶]]0.3g/L的低钙（50μmol/L）Tyrode氏液灌流5min。取下心脏，去掉[[心房]]和基底部组织，将左心室肌剪碎，用吸管缓慢吹打，于含1%[[牛血清]][[白蛋白]]的低钙Tyrode氏液中37℃孵育15min,再将细胞悬液用直径200mm单层[[尼龙]]网过滤，滤液在无钙Tyrode氏液中分步复钙至Ca2+浓度为1.25×10-6mol/L［第一次复钙：20ml细胞[[混悬液]]+20ml无钙液+70μl（72mmol/L）钙母液,10min～15min后吸取上端20ml悬液,第二次复钙:20ml细胞混悬液+20ml无钙液+14μl（720mmol/L）钙母液,10min～15min后吸取上端20ml悬液,第三次复钙:20ml细胞混悬液+20ml无钙液+28μl（720mmol/L）钙母液，10min～15min后吸取上端20ml悬液，其余部分过滤，10min～15min后吸取上端20ml悬液］。心肌细胞在室温下静置1h～2h后且[[镜检]]成活率大于80%。

1.3随机分组方法对照组（Con组，）：置于无氧[[乳酸]]林格氏液;高钾停搏液组(CP组)：置于含20mmol/LKCl的无氧乳酸林格氏液;匹那地尔组(CP+P组)：置于含20mmol/LKCl和50mmol/L匹那地尔的无氧乳酸林格氏液;格列苯脲拮抗组(CP+P+G组)：置于含20mmol/LKCl、50mmol/L匹那地尔及10mmol/L格列苯脲的无氧乳酸林格氏液。以上各组细胞均在24℃下保存2h，然后用95％O2＋5％CO2饱和的K-H液复灌，镜下选择[[横纹]]清晰，[[胞膜]]光整的杆状活细胞来进行实验。匹那地尔和格列苯脲的用量见文献［6］。

1.4检测指标

1.4.1单细胞舒缩测定100μl细胞悬液滴于自制灌流槽中并用95％O2＋5％CO2饱和的K-H液持续灌流（2ml/min）。以0.2Hz频率，50V强度的电场刺激心肌细胞，视频跟踪计算机系统(MedEase-1，南京美易科技有限公司)检测舒缩参数［收缩幅度(dL)，最大收缩速度(+dL/dtmax)，最大[[舒张]]速度(-dL/dtmax)和舒张末期长度］。存储动态图像用MedEase软件分析［5］。心肌细胞在复氧、复灌3min时的各舒缩参数为基础值，之后连续灌注20min,每隔5min测定一次舒缩参数。

1.4.2细胞内钙瞬态测定用细胞内双波长钙荧光系统（T.I.L.L，PhotonicsGmbH,Grfelfing德国）检测细胞内游离钙浓度，Fura-2/AM为钙指示剂。先用10-6mol/LFura-2/AM在室温下负载30min，在频率为0.2Hz，强度为50V的电场刺激下产生的细胞内钙离子浓度峰值为钙瞬态。光信号通过T.I.L.L放大器经Digidata1200输入计算机，pClamp7.0软件分析。荧光激发波长分别为340nm和380nm，发射波长510nm，其荧光比值可反映细胞内钙离子浓度［5］。心肌细胞在复氧、复灌3min时的钙瞬态为基础值，之后连续灌注20min,每隔5min测定一次钙瞬态。

1.4.3肌浆网内贮钙释放功能测定［7］复灌的心肌细胞在电刺激下稳定5min，停止刺激15s加入[[咖啡因]]（10mmol/L）［8］。咖啡因诱导的钙峰与电刺激诱导的钙峰的比值来表示肌浆网内贮钙释放的
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