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2014-02-05T15:55:58Z

以“{{百科小图片|bkbw7.jpg|引物的结合}} 引物，是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为...”为内容创建页面

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{{百科小图片|bkbw7.jpg|[[引物]]的结合}}
引物，是一小段[[单链]]DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在[[核酸]]合成[[反应时]]，作为每个[[核苷酸]]链进行延伸的出发点而起作用的[[多核苷酸]]链，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3′-OH，必须是游离的。　　
==类型==
存在有自然中生物的DNA复制引物（RNA引物）和[[聚合酶链式反应]](PCR)中人工合成的引物（通常为

DNA引物）。一般所说引物，指DNA引物，以下简称引物。　　
==引物设计原则==
引物是人工合成的两段[[寡核苷酸]]序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA[[模板链]]互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。

在PCR（聚合酶链式反应）技术中，已知一段目的[[基因]]的[[核苷酸序列]]，根据这一序列合成引物，利用PCR[[扩增技术]]，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA[[聚合酶]]作用下进行延伸，如此重复循环，延伸后得到的产物同样可以和引物结合。

PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地[[扩增]]模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。

1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。


DNA序列的保守区是通过[[物种]]间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。

2.引物长度一般在15~30[[碱基]]之间。 

引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。


GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的[[解链温度]]，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使[[复性]]条件最佳。

4.引物3′端要避开[[密码子]]的第3位。 

如扩增[[编码区]]域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

5.引物3′端不能选择A，最好选择T。


引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。

6. 碱基要随机分布。 

引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚[[嘧啶]]的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。


引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成[[发夹结构]]（Hairpin）使引物本身复性。这种[[二级结构]]会因空间[[位阻]]而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。

两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物[[二聚体]]（Dimer与Cross dimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。

8. 引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低。 

△G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部[[碱基对]]的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′ 端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo 6软件进行分析）

9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。


引物的5′ 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括：加[[酶切位点]]；标记[[生物素]]、荧光、[[地高辛]]、Eu3+等；引入[[蛋白质]]结合DNA序列；引入[[点突变]]、插入[[突变]]、缺失突变序列；引入[[启动子序列]]等。

引物的延伸是从3′ 端开始的，不能进行任何修饰。3′ 端也不能有形成任何二级结构可能。

10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。

某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6l kJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

11. 引物应具有特异性。

引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。

值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。

做Real Time时,用于SYBR Green I法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：

●避免重复碱基，尤其是G.

●Tm=58-60度。

●GC=30-80%.

●3'端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.

●正向引物与[[探针]]离得越近越好，但不能重叠。

●PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150 bp最为合适（可以延长至300 bp）。

●引物的退火温度要高，一般要在60度以上；

要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。

而且引物设计时应该考虑到引物要有不受[[基因组]]DNA污染影响的能力，即引物应该跨[[外显子]]，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。

做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。

关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。　　
==常用引物设计软件==
■Oligo 6

Oligo 6是目前使用最为广泛的一款引物设计软件，除了可以简单快捷地完成各种引物和探针的设计与分析外，还具有很多其{{百科小图片|bkbw8.jpg|}}他同类软件所不具有的高级功能：

● 已知一个PCR引物的序列，搜寻和设计另一个引物的序列；

●按照不同的物种对MM子的偏好性设计简并引物；

● 对环型DNA片段，设计反向PCR引物；

●设计多重PCR引物；

●为LCR反应设计探针，以检测某个突变是否出现；

●分析和评价用其他途径设计的引物是否合理；

●[[同源]]序列查找，并根据[[同源区]]设计引物；

●增强了的引物/探针搜寻手段。设计引物过程中，可以"Lock"每个参数，如Tm值范围和引物3’端的稳定性等；

● 以多种形式存储结果；支持多用户，每个用户可保存自己的特殊设置。

■Primer Premier 5.0

Primer Premier 5.0 是一种用来帮助研究人员设计最适合引物的应用软件利用它的高级引物搜索引物数据库巢式引物设计引{{百科小图片|bkbw9.jpg|}}物编辑和分析等功能可以设计出有高效扩增能力的理想引物也可以设计出用于扩增长达50kb以上的PCR产物的引物序列。

该软件主要由GeneTank 序列编辑，Primer 引物设计，Align 序列比较，Enzyme 酶切分析和Motif [[基序]]分析等几个主要功能板块组成。

[[分类:RNA]][[分类:分子生物学]][[分类:基因]]

引物 - 版本历史

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