2014年3月12日 (三) 15:04 Admin

2014-03-12T15:04:22Z

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2014-01-25T18:20:44Z

以“巨细胞包涵体感染是由巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）引起的先天性或后天性感染，有两种类型，多数成为[[唾液腺]...”为内容创建页面

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[[巨细胞]]包涵体感染是由[[巨细胞病毒]]（cytomegalovirus，CMV）引起的先天性或后天性[[感染]]，有两种类型，多数成为[[唾液腺]]的不显性感染或慢性感染而长期存留。另一种是全身性[[疾病]]，称[[巨细胞包涵体病]]（cytomegalic inclusion disease），比较少见，主要侵犯小[[婴儿]]，其特点是在很多[[器官组织]]内发现含核内和胞浆内包涵体的巨大[[细胞]]，并伴有全身[[症状]]，是宫内[[病毒感染]]导致[[胎儿]][[畸形]]的重要原因之一。　

CMV感染在全世界分布，人是CMV的唯一[[宿主]]。不同国家及不同经济状况[[感染率]]不同。成人CMV感染和[[免疫功能]]有密切关系。　　
==病原体==
巨细胞病毒属[[疱疹]]病毒群，具有典型的疱疹病毒样结构，是一种大DNA病毒，直径为80-110纳米，病毒壳体为20面对称体，含有162个[[壳粒]]。周围有单层或双层的类[[脂蛋白]]套膜。它有1个[[血清型]]，可分3个以上亚型。它只能在活细胞中生长，一般用人的[[纤维]][[母细胞]]培养。它在体外生长缓慢，复制周期为36-48小时。被巨细胞病毒感染的细胞在[[光学显微镜]]下检查可见到细胞和核变大，有包涵体形成。核内包涵体周围与[[核膜]]间有一轮“晕”，因而称为“猫头鹰眼细胞”，这种细胞具有形态学诊断意义。　　
==诊断==
单靠[[临床表现]]不能诊断CMV感染，从临床[[标本]]中分离出病毒，同时[[抗体]]呈出4倍以上增加或持续[[抗体滴度]]升高，将有助于诊断。　　
===一、病毒分离===
最好用[[唾液]]、尿液、[[生殖]]道分泌物、乳汁和[[白细胞]]，[[接种]]到人的[[成纤维细胞]]内繁殖和分离，细胞病变效应（CPE）在1天或数周后出现，经固定和HE[[染色]]后可观察到[[巨细胞]]，核内有内包涵体，核周晕圈及嗜酸性胞浆内包涵体，很象“猫头鹰眼”（owl′s eye）亦可用单克隆或[[多克隆抗体]]的荧光染色等方法检查。　　
===二、[[血清抗体]]检测===
最常用的有[[补体结合试验]]（CF）、间接免疫荧光试验（IIF）、[[免疫]]酶试验（EIA）、[[间接血凝试验]]（IHA）和放射免疫试验（RIA）等检测CMV-IgG和IgM抗体。当单份[[血清标本]]已确定既往有CMV感染时，应当立即留血清标本，以及间隔2周、4周、8周再留血清标本，结合病毒分离可作原发感染诊断。　　
===三、DNA[[探针]]===
已广泛应用于检测CMV，其中以32P标记的探针敏感性最高，对某些标本来说，杂交方法可能比病毒分离更敏感。　　
===四、[[聚合酶链式反应]]（PCR）===
（一）标本的采集及处理

采集的标本包括患者的[[血液]]、尿，以及腺体组织等。由全血制备的[[血沉]]棕黄层（buffy coats）可保存于-80℃；尿液标本可保存于液氮中。冻存标本应避免反复冻融。

尿液标本经2500r/min离心10min，以除去细胞碎片，收集[[上清液]]。由于尿液中含有PCR[[抑制剂]]，因此需用[[聚乙二醇]]（PEG6000）进行[[预处理]]：50μl尿上清与50μl 20%PEG6000和25μl 2mol/L NaCl混合，置冰浴中6h；15000r/min离心30min收集沉淀。再于6400r/min离心3min；尽可能吸去上清，将沉淀悬浮于[[蒸馏水]]中。该悬液可直接用于PCR[[扩增]]；扩增时应于100℃加热10min，迅速置冰浴中冷却。

（二）模板DNA的制备

1．由[[血液标本]]制备模板DNA

方法A：向[[血清]]中加入NaCl使最终浓度为150mmol/L；取10μl 此血清于70℃处理45s后即可直接进行PCR扩增。

方法B：由血沉棕黄层（BCP）制备：① 用PBS洗涤BCP两次，收取沉淀。② 加入500μl 6mol/L[[盐酸]]胍，[[匀浆]]。③ 加入30μl 10mmol/L EDTA，10mmol/L NaCl，30μl20% Sarcosyl和5μl [[蛋白酶]]K（10mg/ml），混合均匀，60℃反应1h。④ 加入1130μl 的[[乙醇]]，-20℃沉淀1～2h。⑤ 离心收集DNA沉淀。⑥ 用70%乙醇洗两次，最后将沉淀悬浮于少量10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA中。置4℃备用。

2.由冰冻组织标本制备模板DNA：① 用恒冷[[切片机]]切取一块～10μm冰冻组织块，置于1.5ml塑料管中。② 加入10%用[[缓冲液]]配制的福马林。③ 10min后离心1～2min轻轻倾去上清液，沉淀用乙醇洗2次。④ 于室温干燥10～60min。⑤ 加入抽提缓冲液（100mmol/L Tris-HCl，4mmol/L EDTA、pH8.0,400μg/ml蛋白酶K），使刚好浸没沉淀物（约50～100μl ）；将沉淀捣碎。福马林固定的或[[石蜡]]包埋组织经脱蜡和干燥后也可按此处理。⑥ 37℃放置过液。⑦ 置沸水中7min灭活蛋白酶K。⑧ 离心收集上清，取1～10μl 即可进行PCR扩增。

3.由尿液标本制备模板DNA：①100μl 尿上清液与100μl 6mol/L异硫氰酸胍，7μl 2mol/L NaCl和20μl 玻璃粉悬液（DNA PREP，Asahi Glass Co，Tokyo）混合。② 室温放置10min后，6400r/min离心2min，收集沉淀。③ 沉淀用50%乙醇，10mmo/L Tris-HCl、pH7.4, 50mmol/L NaCl洗一次，6400r/min离心1min。④ 同样洗涤沉淀2次，收集沉淀。⑤ 加入50μl 蒸馏水，于55℃作用15min。⑥ 15000r/min离心2min，收集上清（含HCMV DNA），进行PCR扩增，将此悬液于100℃加热10min，并迅速于冰浴中冷却。

（三）[[引物]]及探针

引物及探针的设计是根据已发表的CMV的直接早期[[蛋白]][[基因]]的[[启动子]]区和开始的4个[[外显子]]序列、[[晚期]][[抗原]]gp64基因以及[[磷酸]]化蛋白pp71基因序列。常用的引物和探针列在表3中。

（四）PCR扩增步骤

1．10×反应缓冲液：100mmol/L Tris-HCl、pH8.4，500mmol/L KCl，25mmol/L MgCl2，2mg/ml[[明胶]]。

Taq DNA [[聚合酶]]：5U/μl 。

10×dNTP：4种dNTP各2.0mmol/L。

引物：100pmol/L。

2．常规PCR扩增

10×反应混合物（50μl）反应缓冲液 5μl

10×dNTP 5μl

模板DNA 5μl

Taq DNA聚合酶 0.2μl (IU)

引物各0.5μl

蒸馏水 3.8μl

加1～2滴矿物油。

将反应混合物于94℃加热5min；然后于95℃ 30s，55℃ 40s，72℃ 60s，扩增35～40循环。

3．套式（nested）PCR扩增：①反应混合物的组成同（2），仅引物为IE2a和IE4b（包括了整个外显子3，共721b），各100pmol。于94℃ 60s，52℃150s，72℃ 480s，扩增20循环。② 取2μl 上述扩增产物，各加100pmol的引物IE3a和IE3b补加其他[[试剂]]。然后，于94℃ 60s，52℃150s，72℃180s，扩增20循环。　　
===（五）产物鉴定===
扩增产物的分析可采用固相（滤膜）杂交和液相杂交试验。

1．固相杂交：

① 预杂交液为3×SSPE，5×Denhardt，0.5%SDS和25%[[甲酰]]胺.含有扩增产物的滤膜于42℃预杂交30～60min。② 加入标记探针（10cpm/μg，2ng/ml），杂交30～60min。③ 用0.2×SSPE,.01%SDS分别于室温洗涤滤膜3次,5min/次;于60℃洗一次,10min/次;再于室温洗一次以上,5min/次。④ 自显影。

2．液相杂交及电泳分析：

① 取1/10体积的扩增产物与0.5～1.0pmol末端记的探针混合。② 加入最终浓度为150mmol/L NaCl，10mmol/L[[磷酸钠]]及1mmol/L EDTA溶液，使总体积为20μl 。③ 95℃ 10min，然后于56℃ 60min。④ 离心10s加入样品缓冲液，于8%[[聚丙烯酰胺凝胶]]中进行电泳。⑤ 电泳毕，用溴化乙锭染色，然后对X线片曝光，自显影。

HCMV DNA[[分子]]很大，其[[碱基]]序列尚未全部搞清。虽然它的DNA的[[限制性内切酶]]片段长度具多形性，但是对其[[基因组]]的离散性还不清楚。用单一引物对进行PCR扩增，可鉴定90%的HCMV野型分离株；而采用针对不同HCMV序列的两套以上的引物对，则可检测几乎所有的[[病毒株]]。因此，可根据情况使用两对或两对以上的位于基因组不同区域的引物进行PCR检测。

在HCMV模板DNA制备过程中，有时会产生一些小片段DNA，在PCR[[反应时]]常导致一定水平的[[本底]]产物，从而影响对结果的判定。在这种情况下可采用套式PCR法，其基本原理就是靶DNA的扩增分为两步：首先利用一对引物，扩增包括靶DNA在内的长片段DNA；然后取少量的扩增产物，利用只针对靶DNA的引物再进行第二次扩增。通过控制每步中的扩增循环数，即可防止由小片段DNA引起的[[假阳性]]。这种方法也可避免产生[[假阴性]]结果。

PCR检测HCMV标本具有很高的敏感性。从HCMV感染的[[组织培养]]上清可检测到相当于几十个病毒的DNA分子或1～5PFU病毒的DNA序列。用非放射性[[寡核苷酸探针]]进行Southern杂交分析扩增产物，可从尿液标本中检测到1pgHCMV DNA序列的水平；利用该系统，在4×104个细胞中只有一个[[病毒基因组]]即可检测出，较斑点印迹杂交提高2×103倍。

PCR技术对HCMV感染的检测具有临床应用价值，因为体液中病毒DNA先于[[病毒感染]]的临床[[症状]]或[[血清学]]证据的出现，可作为HCMV感染的早期指标。由于HCMV可通过[[胎盘]]内感染、产道感染等途径传播，而且受感染的[[新生儿死亡率]]较高，因此利用PCR进行早期诊断及采取及时的治疗措施，对[[优生优育]]也有重要意义。利用这种方法，还可鉴定器官或[[组织移植]]手术中[[供体]]是否为HCMV与许多严重[[病症]]的关系。再者，PCR检测指标稳定，还可进行半定量分析，因此可作为评价各种[[抗病毒药物]]疗效的手段。　　
==治疗措施==
巨细胞病毒感染的治疗，可应用各种抗病毒制剂如GCV、抗巨细胞病毒的[[免疫球蛋白]]制剂、[[干扰素]]及[[转移因子]]等。但这些药物并不能解决根本问题，往往停药后病毒又潜伏地回升，鉴于此种病毒可能作为[[艾滋病]]的病因之一，各国学者均在致力于控制其感染的研究。最近，美国学者研制出两种[[活疫苗]]，初试后颇见效。一种是由AD169[[菌株]]研制成的；另一种是从TOWn菌株制成的，经非肠道给药后，已明显表现出有抗巨细胞病毒的效能，CMV抗体升高，导致免疫功能增强。　　
==[[病原学]]==
CMV属于疱疹病毒群，是人类疱疹病毒组中最大的一种病毒，其形最大由162个壳粒（capsomer），正20面体构成。有典型的疱疹病毒结构。CMV只能在人纤维母细胞培养中[[增殖]]，而不能在其他[[动物细胞]]中生长，增殖非常缓慢，初次分离需一个多月才能出现特殊的细胞；细胞变园，[[膨胀]]，细胞及核巨大化，核周围出现一轮“晕”的大型嗜酸性包涵体。

CMV在20%[[乙醚]]中最多存活2小时。pH<5时，或置于56℃30分钟，或[[紫外线]]照射5分钟可被充分灭活。CMV的[[感染性]]对冻融或存于-20℃或-50℃均不稳定，10%的家用[[漂白粉]]可使其感染性明显降低。　　
==发病机理==
CMV感染可引起机体的免疫功能降低，特别是[[细胞免疫]]功能下降。CMV感染对[[胸腺]]发育及[[脾细胞]]、[[单核吞噬细胞]]、NK细胞及CTL细胞的功能有着显著的影响。　　
===一、对胸腺、[[脾脏]]的影响===
实验室急性CMV感染的新生豚鼠，胸腺发育受抑，T细胞数减少，成年鼠感染CMV后，88%胸腺可检出CMV。

CMV感染致脾功能受影响，脾脏[[淋巴细胞]]对conA刺激的增殖下降，脾细胞产生的IL-2显著降低。　　
===二、对[[免疫细胞]]的影响===
CMV感染引起的[[免疫抑制]]与病毒在细胞内的复制有关。CMV可以在单核吞噬细胞、T细胞、B细胞及一些尚未确定的[[单核细胞]]中复制，其中单核吞噬细胞最易感染CMV，淋巴细胞在[[免疫反应]]中具有重要的调节功能和效应功能。CMV感染后，可引起淋巴细胞的多种免疫功能受损。

CMV感染多表现为急性单核细胞增多症。外周[[血淋]]巴细胞对[[有丝分裂]]原、CMV抗原和HSV抗原增殖反应减弱，诱导干扰素水平下降，CD4/CD8比值从1.7±0.7下降为0.2+0.2,T细胞活性降低.这种变化有的可持续相当长时间,病后10个月，大多数患者T细胞[[亚群]]比例仍未完全恢复正常。

CMV感染的免疫抑制作用主要是被病毒感染的大单核细胞和CD8细胞的功能异常所致。单核吞噬细胞在抗CMV免疫中起着枢纽作用，不但可以直接吞噬、杀伤病毒，更重要的是可以处理、提呈抗原，[[分泌细胞]]因子，调控和扩大免疫反应。当CMV感染后，单核吞噬细胞功能受到影响，CMV感染[[巨噬细胞]]引起其吞噬功能降低，细胞内[[氧自由基]]产生减少，FC[[受体]]、[[补体受体]]的表达发生改变，且其抗原提呈功能降低，产生IL-1降低，对IL-1及IL-2的反应亦降低。Moses等用[[胸腺细胞]]增殖试验检测，IL-1活性降低，IL-1产生降低可引起TH/TS细胞比例失衡。

NK细胞有[[拮抗]]CMV扩散的作用。NK细胞积极参与了抗CMV感染的全过程，但存在高的NK活力不一定是保护性应答，而是活动性感染的证明。NK细胞虽不能阻止[[原发性]]CMV感染的出现，但一旦存在感染后，NK细胞能在CMV感染早期出现，有限制扩散、使感染局限的作用。NK细胞、CTL细胞是抗CMV的重要[[效应细胞]]。在CMV复制早期，感染性病毒体产生前，它们能裂解感染细胞，使病毒在细胞间扩散[[流产]]。在小鼠模型中，病毒作用了3-5天时，抗病毒效应由NK细胞介导，NK细胞活性可由IFN增强。6-21天，脾、外周血存在CTL细胞的杀伤活性。NK细胞、CTL细胞活性的高低决定了机体对CMV感染的敏感性及感染恢复的难易性。但CMV感染时，NK细胞及CTL细胞活性亦受到严重影响。此外，特异性细胞免疫有阻止CMV感染再发作用。有人检测了20个发生CMV感染[[肾移植]]受者T细胞应答，发现有14个有CMV[[细胞毒]]应答，而6个不出现细胞毒应答者有严重的临床后果。因此，特异性T细胞存在，有阻止CMV感染再发的作用。　　
===三、抗体有降低CMV感染的[[毒力]]作用===
机体受CMV的感染后，可出现多种抗体。乳汁、宫颈分泌物、唾液中尽管有[[特异性抗体]]出现，包括[[中和抗体]]。但仍能检出CMV，说明抗体并不能阻止病毒扩散。[[胎儿]]从母体被动获得的抗体不能阻断经宫内、产道或乳汁传播的感染。研究证明，致死性CMV攻击前，在小鼠腹腔或[[静脉]]注入0.2ml高效价抗CMV[[球蛋白]]，可完全保护动物免于死亡。1个月后再用CMV等二次攻击，动物仍全部存活，表明抗体有降低CMV的毒力作用。

初次感染后，CMV将在宿主细胞中无限期存在成潜伏状态。可能累及多种组织器官，[[尸检]]提示肺、肝、胰、[[唾液腺]]、[[中枢神经系统]]及肠也可能是病毒潜伏场所。先天性感染的严重程度，与缺乏产生沉淀抗体的能力和T细胞对CMV的应答有关。儿童和成年人感染CMV后，在外周血中出现具有[[抑制细胞]]毒[[表型]]的[[活化]]T淋巴细胞，如果宿主的T细胞功能受损，潜伏的病毒就可能复活并引起多种症候群。组织移植后发生的慢性刺激，为CMV活化，诱发[[疾病]]提供了条件。某些针对T细胞的强烈[[免疫抑制剂]]如[[抗胸腺细胞球蛋白]]，与临床CMV症候群高发率有关。此外，CMV在功能上可作为辅助因子，使潜伏感染的HIV活化。　　
==[[流行病学]]==
CMV感染在全世界分布，人是CMV的唯一宿主。不同国家及不同经济状况感染率不同。成人CMV感染和免疫功能有密切关系。如因[[器官移植]]而接受免疫抑制剂治疗者，常因所供器官和输入血液中有潜伏病毒，或免疫抑制使潜伏的病毒活化而发病，艾滋病患者的CMV感染[[发病率]]高。

[[传染源]]是病人及其急性带毒者，病毒可由乳汁、唾液及尿排出，可持续数周到几年，人类易于感染，[[传播途径]]多种多样。属于性传播性疾病。多从[[精液]]，宫颈分泌物，泪液及粪便（[[口腔]]性欲，吻肛）感染所致。

[[同源性]]CMV感染是[[输血]]和器官移植的一种严重危害，多次输血或一次大量输血使原发和再发感染的危险性增高，输入含白细胞血液的危险性更高，器官或[[骨髓移植术]]后CMV感染率也高。　　
==临床表现==
CMV感染的自然史很复杂，在原发性感染以后排毒，往往持续数周、数月甚至数年，然后感染转为潜伏。常有复发感染伴重新排毒。甚至在原发感染后很多年，潜伏病毒再激活，也可能有不同[[抗原性]]病毒株的再感染。CMV感染的临床表现与个体免疫功能和年龄有关。不论从[[垂直感染]]、平行传播或[[医源性感染]]所出现的症状与[[体征]]都是多种多样的。

关于后天性CMV感染症，在临床中常见于输血后的[[单核细胞增多症]]，由于免疫功能缺陷而发生[[血管]]、[[网膜炎]]、[[肺炎]]以及[[消化道感染]]。并且大多数患者合并格-巴氏[[综合征]]。　　
==巨细胞病毒感染传染源==
传染源是患者和无症状的[[隐性感染者]]。他们可长期或间歇地自唾液、精液、尿液、乳液和子宫颈分泌物中排出病毒。如果与有巨细胞病毒感染的异性[[性交]]，而恰好此人此时处于排毒期，则可能被感染。如果孕妇在性生活时染上病毒，则可引起胎儿感染和[[围产期]]感染。据统计，由原发性巨细胞病毒感染的孕妇所造成的[[新生儿]]的感染率可高达23%，而围产期感染比宫内感染的百分率更高。有人报道约13%的母亲的初乳和乳汁中有病毒排出。此外，输血也常发生巨细胞病毒感染，感染的发生率与输血的数量呈正比，尤其是当血清阳性的供血者给血清阴性的受血者输血时，其感染的危险性最高。此外，长期接受免疫抑制剂治疗的肾移植者中，有90%在尿中可查到病毒，或抗体明显增高。艾滋病患者比正常人更易遭受病毒感染，或使原潜伏在体内的病毒复活。

[[分类:疾病]][[分类:性病]]
==参考==
*[[家庭诊疗/巨细胞病毒感染|《默克家庭诊疗手册》- 巨细胞病毒感染]]
*[[基因诊断与性病/巨细胞病毒感染症|《基因诊断与性传播疾病》- 巨细胞病毒感染症]]
==健康问答网关于巨细胞病毒感染的相关提问==
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 *[[基因诊断与性病/巨细胞病毒感染症|《基因诊断与性传播疾病》- 巨细胞病毒感染症]]
-==健康问答网关于巨细胞病毒感染的相关提问==
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巨细胞病毒感染 - 版本历史

2014年3月12日 (三) 15:04 Admin

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