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2014-02-05T22:20:23Z

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[[多聚酶链式反应]]（PCR）：一种体外[[扩增]]DNA的方法。PCR使用一种耐热的[[多聚酶]]，以及两个含有20个[[碱基]]的[[单链]][[引物]]。经过高温变性将模板DNA分离成两条链，[[低温]]退火使得引物和一条模板单链结合，然后是中温延伸，反应液的[[游离核]]苷酸紧接着引物从5‘端到3’端合成一条互补的新链。而新合成的DNA又可以继续进行上述循环，因此DNA的数目不断倍增。

多聚酶链式反应( PCR) [[基因扩增]]及[[琼脂糖凝胶电泳]]检测

来源：不详收集整理：21世纪生物网站　　
==实验目的==
通过本实验学习PCR反应的基本原理，掌握PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。　　
==实验原理==
PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过[[引物延伸]]而进行的重复双向DNA合成。基本原理及过程如下：

PCR循环过程中有三种不同的事件发生：（1）模板变性；（2）引物退火；（3）热稳定DNA[[聚合酶]]进行DNA合成。

1．变性：加热使模板DNA在高温下（94-95℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。

2．退火：在体系温度降至37-65℃，模板DNA与引物按[[碱基配对]]原则互补结合，使引物与[[模板链]]3’端结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。

3．延伸：体系反应温度升至中温72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种[[脱氧核苷]]三磷酸（dNTP），按5’到3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。

上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍(应该是十的六次至十的九次，是百度无法打出科学计数法，因此写成了106~109）。

典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应[[缓冲液]]、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。　　
==琼脂糖凝胶电泳原理==
琼脂糖凝胶电泳的原理：[[琼脂糖]]是一种天然聚合长链状[[分子]]，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，[[凝胶]]孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及[[构型]]不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA[[复合物]]，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA。　　
==实验材料及相关[[试剂]]==
[[基因组]]DNA，[[基因]]特异性引物，PCR扩增相关试剂，等　　
==实验步骤==
1．模板DNA的抽提：实验一所得的水稻基因组DNA。

2．PCR操作 (在冰上操作)：

（1）PCR反应混合液的配制：反应体系25 &micro;L, 在[[无菌]]的0.2 mL[[离心管]]中按下列操作程序加样：

（2）将反应混合液混匀, 然后每个PCR管中分装24 &micro;L反应混合液，再加1 &micro;L模板DNA，最后加1滴[[石蜡油]]，防止水分[[蒸发]], 然后稍离心。

（3）将PCR管放到PCR热循环仪中，按下列程序开始循环：

（4）注意事项

由于PCR灵敏度非常高，所以应当采取措施以防反应混合物受痕量DNA的污染。

a. 所有与PCR有关的试剂，只作PCR实验用，而不挪作它用。

b. 操作中所用的PCR管、离心管、吸管头等都只能一次性使用。

c. 每加一种反应物，应换新的枪头（加样器的塑料吸嘴的俗称）。

3．PCR产物的检测：

琼脂糖浓度（1.2%）；EB浓度（5 &micro;l / 100 ml TBE）

（1）制胶（以150 mL为例）

a. 称取1.8 g 琼脂糖，加入150 ml 的TBE缓冲液（pH 8.0），摇匀，用电子[[天平]]称三角瓶的总重量。

b. 电炉上加热，至琼脂糖完全溶解；然后在天平上加[[蒸馏水]]至原重量;

c. 用凝胶将制胶板两端封好，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃），倒入其中，直至厚度为4～6 mm（如有气泡要把气泡赶出），在室温下冷却凝固(约30~ 45 min)；

d.将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。

（2）点样

a. 将2.0 &micro;l 溴酚蓝加入到PCR产物中，然后稍微离心；

b. 每孔点样10.0 &micro;l，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。

（3）电泳

打开电源开关，调节电压至3~5 V/cm(约100 V)，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约1小时后即可观察。

（4）[[染色]]

将电泳好的凝胶放入含EB的水溶液中, 染色15-20分钟。

（5）观察

将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上，戴上防护观察罩，打开[[紫外灯]]，可见到橙红色[[核酸]]条带，根据条带粗细，可粗略估计该样品DNA的浓度。如同时有已知分子量的标准DNA进行电泳，则可通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。

（6）注意事项

a. 煮胶时，胶液的量不应超过三角瓶容量的1/3，否则易溢出。

b. 煮好的胶应冷却至50℃左右时再倒，以免制胶板变形，并减少漏胶的机会。

c. 倒胶注意厚度（4-6 mm），充分凝固后再拔出梳子，以保持齿孔形状完好。也可待胶稍凝固后，放入4℃冰箱10多分钟，以加速胶的凝固。

d. 加样前赶走点样孔中的气泡，点样时吸管头垂直，切勿碰坏凝胶孔壁，以免使带型不整齐。

e. 一般情况下不必每点一个样品都换枪头，吸电泳缓冲液洗几次即可再点下一个样品。凝胶中含有EB，切勿直接用手接触胶，废弃胶应集中处理，勿乱丢。

[[分类:分子生物学]][[分类:分子学]]

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