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2014-02-05T14:08:06Z

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（一）[[试剂]]

（1）[[引物]]：决定[[扩增]]的特异性。根据检测的[[DNA]]不同，选用不同引物，每种病原微生

物都有自己特异的引物。

（2）耐热的DNA[[聚合酶]]：此酶是从耐热[[细菌]]中分离出来的，能耐受高温90℃-100℃。

（3）10×PCR[[缓冲液]]：500mmol/l KCl;100mmol/LTris-HCl(pH8.4,20℃)150mmol/L MgCl2,1mg/ml[[明胶]]。10×PCR缓冲液随酶一起购买。

（4）5mmol/L dNTP贮备液：将dATP、dCTP、dGTP和dTTP钠盐各100mg合并，加入[[灭菌]][[去离子水]]溶解，用NaOH调pH至中性，分装每份300μl，-20℃保存。dNTP浓度最好用[[UV]]吸收法精确测定。现用dNTP溶液均有商品化产品。

（5）DNA模板：用处理液将待测[[标本]]处理，不同处理方法、操作各异，但目的是暴露标本中被检测的DNA。

（二）操作程序

过去标准的PCR操作程序是将PCR必需反应成份分别加入一微量[[离心管]]中，然后置于一定的循环参数条件下进行循环扩增。具体如下：

（1）向一微量离心管中依次加入

DNA模板 102-105拷贝

引物　各1μmol/L

dNTP　　各200μmol/L

10×PCR缓冲液1/10体积

ddH2O　补到终体积（终体积50μl-100μl）

混匀后，离心15s使反应成分集于管底。以上步骤仅在实验研究用，现在商品化试剂已将dNTP、10×PCR缓冲液，引物，ddH2O混合在一起，反应体积为20-25μl，只要试验人员加入处理好的样品就可以了。

（2）加[[石蜡油]]50-100μl于反应液表面以防[[蒸发]]。置反应管于97℃变性10min。

（3）冷至延伸温度时，加入1-5u Taq DNA聚合酶，离心30s使酶和反应液充分混合。现在临床使用试剂酶通常已加入反应液中。

（4）PCR的循环程序为：94℃变性30s，55℃退火20s，然后在72℃延伸30s，共循环30-35次。最后一次循环结束后，再将反应管置72℃[[温育]]5min，以确保充分延伸。

PCR尚可用于组织标本DNA的扩增。由于固定组织标本的DNA常发生降解，就给常用的分析方法如Southern转印杂交等带来一定困难。87年Impraim等人首先将PCR技术引入固定包埋组织内DNA分析。他们先从组织标本中提取DNA，再用PCR进行特异性的DNA扩增，应用这种方法，他们成功地从保存30至40年久的组织标本DNA中扩增了HPV[[病毒基因]]片段。但这种方法需要提取DNA，操作比较繁琐。1988年Shibata等人对Impraim的方法进行了改进。他们将固定包埋的组织块制成5-10um厚，0.4cm大小的切片。将切片放入容积为500μl的Eppendorf管内。加入400μl[[二甲苯]][[脱脂]]，离心除去二甲苯，用400μl 95%[[乙醇]]洗去残余二甲苯。离心除尽乙醇、加入100μlPCR反应[[基质]]，将Eppendorf管放入沸水浴中煮10min，然后按前述PCR方法进行DNA扩增。

在应用PCR方法检测[[RNA]][[病毒]]时，首先应将RNA转化成cDNA才能进行扩增，因为PCR只能对DNA模板进行扩增，我们把这种RNA的PCR反应称为[[反转录]]PCR，简称RT-PCR。把由RNA转化成DNA的过程叫做反转录，反转录需要在[[反转录酶]]的作用下完成。
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基因诊断与性病/PCR方法 - 版本历史

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