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2014-02-05T17:23:37Z

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{{百科小图片|bk7d8.jpg|[[基因探针]]}}
基因探针，即[[核酸]][[探针]]，是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的[[基因]]互补的核酸序列(DNA或RNA)。基因探针通过[[分子杂交]]与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的[[基因组]]中把目的基因显示出来。根据杂交原理，作为探针的核酸序列至少必须具备以下两个条件：①应是[[单链]]，若为双链，必须先行变性处理。②应带有容易被检测的标记。它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之[[转录]]而来的RNA。　　
==简要概述==
基因探针（probe）又称“[[寡核苷酸探针]]”，简称“探针”，就是一段与目的基因或DNA互补的特异[[核苷酸序列]]，它可以包括整个基因，也可以仅仅是/基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。

1．探针的来源 DNA探针根据其来源有3种：一种来自基因组中有关的基因本身，称为[[基因组探针]]（genomic probe）；另一种是从相应的基因转录获得了mRNA，再通过[[逆转录]]得到的探针，称为cDNa 探针（cDNa probe）。与基因组探针不同的是，cDNA探针不含有[[内含子]]序列。此外，还可在体外人工合成[[碱基]]数不多的与基因序列互补的DNA片段，称为寡核苷酸探针。

2．探针的制备进行[[分子]][[突变]]需要大量的探针拷贝，后者一般是通过[[分子克隆]]（molecular cloning）获得的。克隆是指用无性繁殖方法获得同一个体、[[细胞]]或分子的大量复制品。当制备基因组DNA探针进，应先制备[[基因组文库]]，即把基因组DNA打断，或用限制性酶作不完全水解，得到许多大小不等的随机片段，将这些片段体外[[重组]]到运载体（[[噬菌体]]、[[质粒]]等）中去，再将后者[[转染]]适当的[[宿主]]细胞如[[大肠]]肝菌，这时在[[固体培养基]]上可以得到许多携带有不同DNA片段的克隆噬菌斑，通过[[原位杂交]]，从中可筛出含有目的基因片段的克隆，然后通过细胞[[扩增]]，制备出大量的探针。

为了制备cDNA 探针，首先需分离[[纯化]]相应mRNA，这从含有大量mRNA的组织、细胞中比较容易做到，如从造血细胞中制备α或β[[珠蛋白]]mRNA。有了mRNA作模板后，在[[逆转录酶]]的作用下，就可以合成与之互补的DNA(即cDNA)，cDNA与待测基因的[[编码区]]有完全相同的[[碱基顺序]]，但内含子已在加工过程中切除。

寡核苷酸探针是人工合成的，与已知基因DNA互补的，长度可从十几到几十个[[核苷酸]]的片段。如仅知[[蛋白质]]的[[氨基酸]]顺序量，也可以按氨基酸的密码推导出核苷酸序列，并用[[化学]]方法合成。

3.探针的标记为了确定探针是否与相应的基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号,通常采用[[放射性同位素]]32P标记探针的某种核苷酸α[[磷酸基]]。但近年来已发展了一些用非同位素如[[生物素]]、[[地高辛]][[配体]]等作为[[标记物]]的方法。但都不及[[同位素]]敏感。非同位素标记的优点是保存时间较长,而且避免了同位素的污染。最常用的探针标记法是[[缺口平移]]法(nick translation)。首先用适当浓度的DNA酶Ⅰ（DNAseⅠ）在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于DNA[[聚合酶]]Ⅰ（DNa poly merasⅠ）的5’→3’的外切[[酶活性]]，切去带有5’[[磷酸]]的核苷酸；同时又利用该酶的5’→3’聚酶活性，使32P标记的互补核苷酸补入缺口，DNA聚合酶Ⅰ的这两种活性的交替作用，使缺口不断向3’的方向移动，同时DNA链上的核苷酸不断为32P标记的核苷酸所取代。

探针的标记也可以采用随机[[引物]]法，即向变性的探针溶液加入6个核苷酸的随机DNA小片段，作为引物，当后者与单链DNA互补结合后，按碱基互补原则不断在其3’OH端添加[[同位素标记]]的[[单核苷酸]]，这样也可以获得比[[放射性]]很高的DNA探针。　　
==DNA探针==
{{百科小图片|bk7d9.jpg|荧光间接标记dna探针检测}}DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百[[碱基对]]以上的双链DNA或单链DNA探针。现已获得DNA探针数量很多，有[[细菌]]、[[病毒]]、[[原虫]]、[[真菌]]、动物和人类细胞DNA探针。这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。这些DNA片段须是特异的，如细菌的[[毒力]]因子基因探针和人类Alu探针。这些DNA探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和应用。以细菌为例，目前分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比之G+C百分比值要准确的多，是细菌[[分类学]]的一个发展方向。加之分子杂交技术的高敏感性，分子杂交在临床微生物诊断上具有广阔的前景。细菌的基因组大小约5×106bp，约含3000个基因。各种细菌之间绝大部分DNA是相同的，要获得某细菌特异的核酸探针，通常要采取建立细菌基因组DNA文库的办法，即将细菌DNA切成小片段后分别克隆得到包含基因组的全信息的克隆库。然后用多种其它菌种的DNA作探针来筛选，产生杂交信号的克隆被剔除，最后剩下的不与任何其它细菌杂交的克隆则可能含有该细菌特异性DNA片段。将此[[重组质粒]]标记后作探针进一步鉴定，亦可经DNA序列分析鉴定其基因来源和功能。因此要得到一种特异性DNA探针，常常是比较繁琐的。探针DNA克隆的筛选也可采用[[血清学]]方法，所不同的是所建DNA文库为可表达性，克隆[[菌落]]或噬斑经裂解后释放出表达[[抗原]]，然后用来源细菌的多克隆[[抗血清]]筛选阳性克隆，所得到多个阳性克隆再经其它细菌的抗血清筛选，最后只与本细菌抗血清反应的表达克隆即含有此细菌的特异性基因片段，它所编码的[[蛋白]]是该菌种所特有的。用这种表达文库筛选得到的显然只是特定基因探针。

对于基因探针的克隆尚有更快捷的途径。这也是许多重要蛋白质的编码基因的克隆方法。该方法的第一步是分离纯化蛋白质，然后测定该蛋白的氨基或[[羟基]]末端的部分氨基酸序列，然后根据这一序列合成一套寡核苷酸探针。用此探针在DNA文库中筛选，阳性克隆即是目标蛋白的编码基因。值得一提的是真核细胞和[[原核细胞]]DNA组织有所不同。[[真核]]基因中含有非编码的内含子序列，而[[原核]]则没有。因此，真核基因组DNA探针用于检测[[基因表达]]时杂交效率要明显低于cDNA探针。DNA探针（包括cDNA探针）的主要优点有下面三点：①这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。②DNA探针不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。③DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法，PCR标记法等，能用于同位素和非同位素标记。

DNA探针可以用来诊断[[寄生虫]]病，现场调查及虫种鉴定，可用于[[病毒性肝炎]]的诊断，遗传性[[疾病]]的诊断，可用于改造[[变异]]的基因，可用于检测[[饮用水]]病毒含量。具体方法：用一个特定的DNA片段制成探针，与被测的病毒DNA杂交，从而把病毒检测出来。与传统方法相比具有快速、灵敏的特点。传统的检测一次，需几天或几个星期的时间，精确度不高，而用DNA探针只需一天。据报道，能从1t水中检测出10个病毒来，精确度大大提高。　　
==RNA探针==
{{百科小图片|bk7da.jpg|高辛标记的rna探针}}RNA探针是一类很有前途的核酸探针，由于RNA是单链分子，所以它与靶序列的[[杂交反应]]效率极高。早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探针，这些RNA是在细胞基因转录或[[病毒复制]]过程中得到标记的，标记效率往往不高，且受到多种因素的制约。这类RNA探针主要用于研究目的，而不是用于检测。例如，在筛选[[逆转录病毒]][[人类免疫缺陷病毒]]（HIV）的基因组DNA克隆时，因无DNA探针可利用，就利用HIV的全套标记mRNA作为探针，成功地筛选到多株HIV基因组DNA克隆。又如进行中的转录分析（nuclearrunontranscrip－tionassay）时，在体外将[[细胞核]]分离出来，然后在α-32P-ATP的存在下进行转录，所合成mR－NA均掺入同位素而得到标记，此混合mRNA与固定于[[硝酸]]纤维素滤膜上的某一特定的基因的DNA进行杂交，便可反映出该基因的转录状态，这是一种反向探针实验技术。

近几年体外转录技术不断完善，已相继建立了单向和双向体外转录系统。该系统主要基于一类新型载体pSP和pGEM，这类载体在多克隆[[位点]]两侧分别带有SP6[[启动子]]和T7启动子，在SP6RNA聚合酶或T7RNA聚合酶作用下可以进行RNA转录，如果在多克隆位点接头中插入了外源DNA片段，则可以此DNA两条链中的一条为模板转录生成RNA。这种体外转录反应效率很高，在1h内可合成近10μg的RNA产生，只要在[[底物]]中加入适量的放射性或生物素标记的NTP，则所合成的RNA可得到高效标记。该方法能有效地控制探针的长度并可提高标记物的利用率。

值得一提的是，通过改变[[外源基因]]的插入方向或选用不同的RNA聚合酶，可以控制RNA的转录方向，即以哪条DNA链以模板转录RNA。这种可以得到同义RNA探针（与mRNA同序列）和反义RNA探针（与mRNA互补），反义RNA又称cRNA，除可用于反义核酸研究外，还可用于检测mRNA的表达水平。在这种情况下，因为探针和靶序列均为单链，所以杂交的效率要比DNA-DNA杂交高几个数量级。RNA探针除可用于检测DNA和mRNA外，还有一个重要用途，在研究基因表达时，常常需要观察该基因的转录状况。在原核表达系统中外源基因不仅进行正向转录，有时还存在[[反向转录]]（即生成反义RNA），这种现象往往是外源基因表达不高的重要原因。另外，在真核系统，某些基因也存在反向转录，产生反义RNA，参与自身表达的调控。在这些情况下，要准确测定正向和反向转录水平就不能用双链DNA探针，而只能用RNA探针或单链DNA探针。　　
==探针标记==
{{百科小图片|bk7db.jpg|质粒的酶切分析}}探针是能与特异靶分子反应并带有供反应后检测的合适标记物的分子。利用核苷酸碱基顺序互补的原理，用特异的基因探针即识别特异碱基序列的有标记的一段单链DNA（或RNA）分子，与被测定的靶序列互补，以检测被测靶序列的技术叫核酸探针技术。探针制备就是将目的基因进行标记。特异性探针有三种形式——cDNA、RNA、[[寡核苷酸]]。cDNA和寡核苷酸是目前最常采用的探针。RNA探针用途很广，也容易获得，但其不稳定性限制了其商业用途。cDNA探针的获得是，将特定的基因片段装载到质粒或噬菌体中，经过扩增、酶切、纯化等复杂的步骤，才能得到一定长度的cDNA探针。这一过程比较复杂，有相应条件的实验室才能做到。寡核苷酸探针是在已知基因序列的情况下，由核酸合成仪来完成，可廉价获得大量的此类探针。质量也相对来说更为稳定。由于cDNA探针长度通常为数百至数千个碱基，所以有良好的信号放大作用，但其渗透性比较差。寡核苷酸探针一般为十数个至数十个碱基，渗透性强，但信号放大作用则较差，合成的多相寡核苷酸探针，敏感性可以达到cDNA探针水平。

探针的标记方式有[[放射性标记]]和非放射性标记。标记物质有放射性元素（如32P等）和非放射性物质（如生物素、地高辛等）。32P是最常用的核苷酸标记同位素，被标记的dNTP本身就带有磷酸基团，便于标记。特点是比活性高，可达9000Ci/mmol；发射的β[[射线]]能量高。用它标记的探针自显影时间短，灵敏度高。32P的半寿期短，虽使用不方便，但为废弃物的处理减轻了压力。非放射性标记法有酶标法和化学物标记法。酶标方法与[[免疫]]测定ELISA方法相似，只是被标记的核酸代替了被标记的[[抗体]]，事实上被标记的抗体也称为探针，现有许多商品是生物素、地高辛标记的。[[血凝素]]与生物素有非常高的亲和性，当血凝素标记上[[过氧化物酶]]或[[碱性磷酸酶]]，经杂交反应最终形成探针-生物素-血凝素酶[[复合物]]（ABC法），酶[[催化]]底物显色，观察结果。ABC法底物显色生成不溶物，以便观测结果。[[酶标记]]法复杂、重复性差，成本高，但便于运输、保存，灵敏度与放射物标记法相当。

探针标记方法有：①缺口平移标记法。利用的是DNA聚合酶I能修复DNA链的功能。该法先由DNaseI在DNA双链上随机切出切口，然后DNA聚合酶I沿缺口水解5&acute;端核苷酸，同时在3&acute;端修复加入被标记核苷酸，切口平行推移。缺口平移法快速、简便、成本相对较低、比活性相对较高、标记均匀，多用于大分子DNA标记，(>1000bp最好)，但单链DNA、RNA不能用该法标记。②随机引物法。随机引物是指含有各种可能排列顺序的[[寡聚]]核苷酸片断的混合物，因此它可以与任意核苷酸序列杂交，起到聚合酶反应的引物作用。将待标记的DNA探针片断变性后与随机引物一起杂交，然后以此杂交的寡聚核苷酸为引物，在[[大肠杆菌]]DNA聚合酶I大断段（KlenowFragment）催化下，合成与探针DNA互补的DNA链，当在反应体系中含有a-32P-dNTP时，即形成放射性同位素标记的DNA探针。具有上述优点，可代替缺口平移法。此外大小、单双DNA均可标记，标记均匀，标记率高，但也不能标记环状DNA。随机引物法标记探针一般长400~600bp。③[[末端标记]]法（又叫尾标）。利用[[末端转移酶]]可进行“尾标”，尾标适用于寡核苷酸探针标记，寡核苷酸探针多用于核酸“点”突变的检测，该探针可用核酸合成仪人工合成，克隆出的探针一般较长，特异性好，标记量大，杂交的检出信号强。

探针合成的注意事项有：①合成探针的长短，一般在20~50个核苷酸之间。合成过长成本高，且易出现聚合酶合成错误，杂交时间长，合成太短则特异性下降。②[[碱基组成]]G-C应含40%~60%，一种碱基连续重复不超过4个，以免非特异性杂交产生。③探针自身序列内应无互补区域，以免产生“发夹”结构，影响杂交。总之，一个好的探针最终要在实践中才能加以确认。　　
==实验应用==
[[禽流感病毒]][[核蛋白]]基因探针制备及其初步应用

{{百科小图片|bk7dc.jpg|探针浓度鉴定}}将禽流感病毒H9N2亚型毒株核蛋白(NP)基因3′端较为保守的、约350bp的[[编码序列]]通过[[限制性内切酶]]Hae&cedil;切割、分离后,用随机引物法制备Digoxigenin2112dUTP标记探针。测定该探针的浓度为100Lg&ouml;ml。特异性试验发现该探针只能与实验室构建的、含有NP基因的重组载体pGEM2TE2NP和pBacPAK2NP以及A型流感病毒H9N2亚型、H3N2亚型以及H9N3亚型毒株基因组RNA结合出现特异性的颜色反应,而与实验室常用的载体pGEM2Teasy、pBacPAK2His3、pTARGET和pGEMEX22以及新城[[疫病]]毒、[[传染性]][[支气管炎]]病毒和传染性喉气管炎[[病毒基因组]]不发生反应。应用该探针检测含NP基因的重组载体和重组病毒证明该探针是有效的,可用于含禽流感病毒样品或材料的检测。

DNA探针原位杂交

1、4-6微米切片，用防脱片胶（多聚[[赖氨酸]]）处理过的玻片贴附

2、56—60℃烤片2-16h

3、新鲜[[二甲苯]]脱蜡，10minX2（趁热脱蜡）

4、100%[[乙醇]]5minX2次，不用浸水，直接空气干燥

5、加入50μl[[蛋白酶]]K工作液（蛋白酶K用[[蒸馏水]]稀释，浓度为25μg/ml），37℃[[消化]]10-15min

6、弃去蛋白酶K工作液，0.1MTBS洗涤3minX3次逐级[[酒精]][[脱水]]（85%，95%，100%酒精）1minX3次然后空气干燥

7、加入20μl探针，加盖薄膜。（探针用预杂交液稀释，浓度为5μg/ml）。

8、95℃变性10-12min；立刻置于冰块上，防止[[复性]]。

9、37℃杂交16—20h

10、揭去薄膜，每张切片加入以下杂交后洗涤液：

>用2-3滴2XSSC37℃洗涤3minX2次；

>0.5XSSC37℃洗涤3minX2次；

>0.2XSSC37℃洗涤3minX2次；

11、0.1MPBS/TBS[[缓冲液]]洗涤，1minX3次

12、滴加小鼠抗地高辛生物素标记的抗体工作液，37℃孵育45—60min；

13、0.1MPBS浸洗，5minX3次

14、滴加高敏碱性磷酸酶链[[亲和素]]复合物工作液，37℃孵育45—60min。

15、0.1MPBS浸洗，5minX3次

16、滴加NBT/BCIP显色6-16h，

17、双蒸水终止反应（37℃10min—2h），双蒸水浸洗，5minX2次

18、滴加核固红，30秒—5min；

19、双蒸水浸洗，5minX3次

20、脱水、透明、封片

[[分类:生物学]][[分类:分子生物学]][[分类:动物学]]
==参看==
*[[医学遗传学/基因探针|《医学遗传学基础》- 基因探针]]

基因探针 - 版本历史

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