112.247.109.102：以“原代培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此...”为内容创建页面

2014-01-26T15:28:48Z

以“原代培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此...”为内容创建页面

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[[原代培养]]是指直接从机体取下[[细胞]]、组织和器官后立即进行培养。因此，较为严格地说是指成功[[传代]]之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留[[二倍体]]数。但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为[[原代细胞培养]]。最常用的原代培养有组织块培养和分散[[细胞培养]]。

==基本介绍(primary culture)==
原代培养也称初代培养，严格的说即从体内取出组织[[接种]]培养到第一次传代阶段，但实际上，通常把第一代{{百科小图片|bk82i.jpg|原代培养}}至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是[[异质]]的（Heterogeneous），也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在[[软琼脂培养]]基中进行培养时，细胞克隆形成率（Cloning Efficiency）很低，即细胞独立生存性差。克隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。初代培养细胞多呈二倍体[[核型]]；由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。

也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的（Heterogeneous），也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行培养时，细胞克隆形成率（Cloning Efficiency）很低，即细胞独立生存性差。克隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。初代培养细胞多呈二倍体核型；由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。　　
==分类==
最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。{{百科小图片|bk82j.jpg|原代培养}}组织块培养是将剪碎的组织块直接[[移植]]在[[培养瓶]]壁上，加入[[培养基]]后进行培养。

分散细胞培养则是将组织块用机械法或[[化学]]法使细胞分散。如欲从[[胎儿]]或[[新生儿]]的组织分离到活性最好的游离细胞，经典的方法是用[[蛋白水解酶]]（如[[胰蛋白酶]]和[[胶原酶]]）[[消化]]细胞间的[[结合物]]，或用[[金属离子]][[螯合剂]]（如EDTA）除去细胞互相粘着所依赖的Ca2+，再经机械轻度振荡，使之成为单细胞。　　
==实验==
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===实验目的===

能独立地进行细胞的原代培养，争取原代培养一次成功。{{百科小图片|bk82k.jpg|原代培养}}<b />　　
===实验原理===
细胞培养是[[生物学]]和医学研究最常用的手段之一，可分为原代培养和[[传代培养]]两种。原代培养是直接从生物体获取细胞进行培养。由于细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、[[代谢]]、繁殖提供有力的手段，同时也为以后传代培养创造条件。利用此方法还可直接服务于临床实践。例如，用从手术中切除的[[肿瘤细胞]]进行原代培养，然后用该培养细胞进行[[抗癌药物]]的筛选，根据肿瘤细胞对加入的[[化疗药物]]的敏感性来帮助选择最有效的[[化疗]]方案，有可能起到增强疗效、降低[[副作用]]的作用。原代培养可分为消化法和组织块培养法，这里统一作介绍。

<b />　　
===实验材料和用品===
材料：培养瓶，[[青霉素]]瓶，小玻璃漏斗，三角烧瓶，平皿，吸管，[[试管]]，[[移液管]]，[[无菌]][[纱布]]，无菌[[眼科剪]]，废液缸，血球计数板，蜡盘，手术器械，大头针，[[离心管]]。孕鼠或新生1。4d乳鼠，75％[[酒精]][[棉球]]，2％碘酒。

药品：培养基(RPMI1640或DMEM)，小牛[[血清]]，0．125％胰蛋白酶，Hanks液，75％酒精，双抗(青霉素和[[链霉素]])。

仪器(请参看仪器图库)：CO2[[培养箱]]．；[[倒置显微镜]]，超净台，[[磁力搅拌器]]，[[离心机]]。<b />{{百科小图片|bk82l.jpg|原代培养}}　　
===实验步骤===
1．取材(以[[胚胎]]小鼠为例)：将孕鼠拉[[颈椎]]处死，投入75％酒精浸泡数秒[[消毒]]，提出孕鼠控掉酒精，放置于蜡盘中用大头针固定。用手术器械逐层分离[[皮肤]]和[[肌肉]]组织，打开腹腔。注意不同的解剖层次使用不同的消毒器械。最后取出[[双角子宫]]置于无菌平皿内。

2．用Hanks液洗涤3次，剪开[[子宫]]取出胚胎。除去子宫、[[血液]]和[[筋膜]]等组织。

3．用弯头剪把胚胎尽量剪碎，每个组织块小于1mm3。在操作时应尽量将平皿盖半盖住平皿以防空气中尘埃落下污染组织。再用Hanks液洗涤2-3次，自然沉淀。用吸管吸去[[上清液]]。以下可按两种方法进行，即消化法和组织块培养法。

4．若使用消化法，则将组织块放人三角烧瓶内加入10-30mL0．125％胰蛋白酶，37℃磁力搅拌消化20多min。然后加人少量血清终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，800r／min离心5-10min收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶中培养。{{百科小图片|bk82m.jpg|原代培养}}5．若进行组织块培养，则不做步骤4，加入几滴血清于组织块中，再用弯头吸管将组织块悬液吸起。在一小培养瓶中逐个铺展开，注意将瓶底涂抹均匀。将瓶子翻转倒置后在37℃培养箱内放置2-3h。待组织块微干与瓶壁粘牢后再轻轻将瓶子翻转过来，从边角加入4-5mL培养基，使细胞接触到培养基，放培养箱内继续进行培养。　　
==操作要领==

===混匀操作要领===
（1）火焰消毒吸管，用Hanks液冷却和湿润管内壁（这是因为刚分离的组织细胞易粘在管壁上）

（2）吸管头插入管底

（3）用吸管反复轻轻吹打组织块　　
===器械的使用===
（1）用工作台消毒[[镊子]]取浸泡在酒精中消毒的器械。

（2）器械置无菌干纱布内嚓一下。迅速通过火焰，冷却后使用。

（3）用过的器械置另一加盖的器皿中再消毒。

（4）器械按浸泡消毒的顺序使用。{{百科小图片|bk82n.jpg|原代培养}}（5）各套再消毒器械不可混用。　　
===除去组织块多余水分===
用吸管将组织块推向青霉素瓶一角，然后将有组织块的瓶面翻向上方，吸去流向对侧的多余水分。

注意：多余水分若不除去，会使组织块剪切不细，消化后的细胞悬液清亮（细胞数少），并可见消化液中消化液中有线状或絮状物漂浮。　　
===[[细胞计数]]===
（1）用吸管混匀待计数的细胞悬液。

（2）将一小滴细胞悬液从[[盖玻片]]与[[载玻片]]交界部位滴入细胞计数池中。

（3）沉降1分钟，低倍镜下计数血球计数板四大中格的结构完整的细胞，[[小细胞]]团计数为1。

（4）计数时，如果细胞压在格上，则数上不数下，数左不数右。然后按下式计算出每毫升悬液中的细胞数。

（四大中格细胞数/4）*10000=细胞数/毫升　　
==注意事项==
一、注意污染

1、严格进行动物皮肤消毒，使用三套器械取材。新生动物皮肤先用2%碘酒液消毒，成年鼠先用3%~5%碘酒液消毒后用75%酒精消毒。

2、严格进行[[无菌操作]]，防止[[细菌]]、霉菌、[[支原体]]污染，避免化学物质污染。

3、吸取液体前，瓶口和吸管硬行火焰消毒；吸取液体时，避免俩这碰撞。

4、离心管入台前，管口、管壁应消毒。

5、实验者离开超净台时，要随时用肘部关闭工作窗。

6、使用过的器械用酒精棉球嚓去血污后，移入另一个器皿中继续消毒，在浸泡器械时剪刀口要叉开放，镊子弯头要向下放，并加盖消毒。二、器材使用时既要注意用火焰消毒，又要防止[[烫伤]]、烫死细胞。经火焰消毒后的吸管一定要用Hanks液冷却。

三、超净台内温度、湿度较大，在夏天工作时台内散热更慢，因此进行细胞悬液混匀、接种时，离火焰要稍微远些。

[[分类:生物]][[分类:实验]]

原代培养 - 版本历史

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