112.247.67.26：以“'''单克隆抗体技术'''(monoclonal antibody technology)，20世纪后期免疫学技术的重大突破，应用B细胞杂交瘤技术产生单克...”为内容创建页面

2014-02-05T09:58:57Z

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'''单克隆抗体技术'''(monoclonal antibody technology)，20世纪后期[[免疫学]]技术的重大突破，应用[[B细胞]][[杂交瘤]]技术产生[[单克隆抗体]](McAb)。 B细胞杂交瘤是[[免疫]]的小鼠[[脾细胞]] （[[B淋巴细胞]]）与小鼠[[骨髓瘤]]（一种[[浆细胞瘤]]，[[浆细胞]]是B淋巴细胞系的终末形式）[[细胞融合]]而成的[[杂交细胞]]，其核内含有双亲[[细胞]]的[[染色体]]，继承了[[亲代]]细胞的特征，它既具有瘤细胞在体外培养中迅速[[增殖]]的能力，又具备免疫脾细胞合成和分泌[[特异性抗体]]的特性。B细胞杂交瘤经过单个[[细胞培养]]，可繁殖成为一个[[细胞系]]（称为[[克隆]]或克隆系），这个过程称为克隆化，而由一个克隆系产生的[[抗体]]称单克隆抗体。这种抗体只能特异地与[[抗原]][[分子]]上的一个[[抗原决定簇]]结合反应，抗体成分均一，抗体的结构、[[氨基酸]]顺序、特异性等都是一致的，且在培养过程中只要不发生[[变异]]，不同时间内分泌的抗体都能保持同样的结构和功能。因此，用这种技术可按人们的意愿生产大量很纯的单克隆抗体，这些都是用普通[[血清学]]方法所不能达到的。这技术在医学和[[生物学]]各个领域中得到广泛应用，并为临床疾病的诊断、治疗提供了新手段。带有多个抗原决定簇的抗原分子注入动物体内，被带有相应抗原决定簇[[受体]]的[[淋巴细胞]]所识别，它们[[活化]]、增殖，每一个 B细胞系分别分泌针对单个抗原决定簇的[[抗体分子]]。普通抗血清是含有这些抗体的混合物。而将免疫小鼠的淋巴细胞与[[骨髓瘤细胞]]融合形成杂交瘤细胞，经过克隆化，所产生的抗体是高度纯一的单克隆抗体。

==B细胞杂交瘤[[单克隆抗体技术]]==

先将免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞在融合剂的作用下融合。融合后加入含有[[饲养细胞]]及[[次黄嘌呤]]－[[氨基蝶呤]]－[[胸腺嘧啶核苷]]([[HAT]])的选择培基中筛选杂交瘤，测定抗体活性，进行克隆化，筛选出能产生所需特异性和性质的抗体的[[亚克隆]]，进行[[扩增]]培养或[[接种]]于同系小鼠的腹腔中，使其在动物体内增殖，从而能获得大量的单克隆抗体。

===骨髓瘤细胞系的选择与培养===

目前常用的适于融合的骨髓瘤细胞系多来自BALB/C小鼠和 Lou系[[大鼠]]。小鼠骨髓瘤细胞早期是采用缺少 HGPRT或TK酶但可分泌[[免疫球蛋白]](无抗体活性)的骨髓瘤细胞 X63-Ag8[[细胞株]]。用X63-Ag8与免疫脾细胞融合形成的杂交瘤细胞，具有能合成两个亲代[[免疫球蛋白重链]]和[[轻链]]的[[基因]]，因而产生特异性抗体机率低。现多采用完[[全不产]]生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞株（称为不产生者），如SP2/O-Ag14、X63-Ag8.653 、FO等细胞系，这样使杂交瘤细胞所分泌的免疫球蛋白只含有免疫脾细胞的[[重链]]和轻链，从而大大提高了所产生特异性抗体的比率。

骨髓瘤细胞系长期[[连续培养]]，可能会产生抗 HAT的[[变种]]，即由缺陷HGPRT回复至能产生HGPRT的[[突变株]]，以致融合率下降。因此每隔3～6个月将骨髓瘤细胞置于含[[8-氮杂鸟嘌呤]]的[[培养液]]中培养，以除去[[回复突变]]的细胞。必要时对骨髓瘤细胞系进行[[再克]]隆，选择质量好的骨髓瘤亚克隆，并深冻一大批以供使用。用于融合的骨髓瘤细胞必须处于活跃的对数[[生长期]]。每隔2～3天应换新的培养液继续[[传代]]一次，可以使用于融合的骨髓瘤细胞保持在对数生长期一周左右，细胞存活率在90～95％。

===免疫的小鼠脾细胞===

由于供融合的小鼠骨髓瘤细胞系均来自BALB/C小鼠，故多选用同系BALB/C小鼠进行免疫。以8～12周龄雌性鼠为宜。大鼠可产生大量抗体，融合时亦可选用大鼠作为免疫脾细胞的[[供体]]。经特定抗原的免疫，小鼠[[脾脏]]中分泌特异性抗体的B细胞数量增加并[[分化]]、增殖为[[浆母细胞]]，这些细胞易与骨髓瘤细胞融合。

[[免疫程序]]与方法各实验室不同，主要依抗原的性质及动物对抗原的[[免疫应答]]反应的不同来设计免疫方案。一般说，可溶化[[蛋白]]抗原的[[免疫原性]]弱，而应用佐剂加强免疫应答反应。初次免疫时将抗原与等量弗罗因德氏完全[[佐剂]]混合，腹腔或[[皮下注射]]。2～4周后以同量抗原加等量不完全弗罗因德氏佑剂腹腔[[注射]]。再过2～6周，在融合前3～4天，腹腔或[[静脉注射]]不加佐剂的抗原作为加强免疫。完整的[[细胞免疫]]原性强，不需应用佐剂。由于动物对抗原的[[免疫反应]]可能有个体差异，最好一次免疫3～5只小鼠，选择免疫反应好的小鼠，取混合脾进行融合，亦可分别取一个小鼠的脾脏分别进行3～5个融合。

融合的骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的比例可以是1:1～1:10。但若脾细胞浓度过高，融合后多数培养孔中有多个杂交瘤细胞生长，使克隆化难以进行。一般在微量的多孔培养板中，每孔加入的融合后细胞总数以2×105个为宜，但最高细胞密度不得超过106个/孔。

===融合剂===

两种细胞间的自发性融合率很低，一般为10-6～10-7。细胞融合剂[[聚乙二醇]](PEG)可促进细胞融合。作用机理可能为使[[脂膜]]易于打开，通常用[[分子量]]1000～4000的50％PEG溶液，在37℃和pH8～8.2，作用1～2分钟效果最佳。有人认为PEG中加[[二甲亚砜]]作为融合剂，效果更好。

===HAT选择杂交瘤细胞===

据报道用108个脾细胞与5×107个骨髓瘤细胞经PEG作用融合后，能存活下来，形成稳定杂交瘤的细胞数只不过100～200个，即以脾细胞计算为1/100万或1/50万，这样[[培养物]]中未融合的骨髓瘤细胞的过度生长，将会干扰杂交瘤细胞的生存。为清除未融合的骨髓瘤细胞并且筛选出杂交瘤细胞，现普遍应用HAT选择[[培养基]]，其中含有次黄嘌呤、氨基蝶呤及胸腺嘧啶核苷。在 HAT培基中小鼠骨髓瘤细胞和脾细胞死亡，而杂交瘤细胞繁殖形成克隆。骨髓瘤细胞内缺乏次黄嘌呤－[[鸟嘌呤]][[磷酸核糖转移酶]] (HGPRT)或胸腺嘧啶核苷[[激酶]](TK)，不能利用培基中的次黄嘌呤或胸腺嘧啶核苷，所以未融合的骨髓瘤细胞不能繁殖。而小鼠脾细胞虽有HGPRT和TK，但缺乏在组织培基中繁殖的能力，一般在两周内死亡。唯有骨髓瘤细胞和脾细胞融合形成的杂交瘤细胞，可以从小鼠脾细胞中获得HGPRT和(或)TK，在HAT培养基中可通过[[核酸]][[代谢]]旁路将次黄嘌呤合成[[嘌呤]]核苷酸和(或)将胸腺嘧啶核苷合成[[嘧啶核苷酸]]，进而合成[[DNA]]。因此杂交瘤细胞能在HAT培养基中繁殖成克隆。

===饲养细胞===

细胞溶合后，用 HAT培基选择杂交瘤细胞时，由于骨髓瘤细胞和脾细胞大量死亡，单个或少数分散的杂交瘤细胞在低密度时不易存活，必需加入其他活细胞才能使之繁殖，这种被加入的活细胞叫做“饲养细胞”。常用的饲养细胞有小鼠腹腔[[巨噬细胞]]、小鼠脾细胞、小鼠或大鼠[[胸腺细胞]]、大鼠[[胚胎]]传代[[纤维]][[母细胞]]或经过γ[[射线]]照射的人胚肺纤维母细胞等。通常多采用腹腔巨噬细胞。饲养细胞可与融合细胞同时加到培养孔中，或提前一天加到培养孔中，由不同品系小鼠或异种鼠取得的腹腔巨噬细胞均同样有效。小鼠腹腔巨噬细胞在效能上有差异，最好每次融合也用2～3个以上的小鼠腹腔混合液。

===阳性杂交瘤细胞的筛选===

细胞融合后，在HAT培养基中培养 5～14天，即可在培养板孔中生长出杂交瘤细胞[[集落]]，此时便可测定抗体活性，对能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，应及早进行克隆化，以防因不产生抗体的杂交瘤细胞过度生长而丢失。另外，开始测定时由于分泌抗体阳性的杂交瘤细胞数尚少，可能测得抗体阴性，因此应重复测定抗体活性2～3次，并在换液后3～4天进行，以便抗体积累。为尽早筛选出分泌抗体的杂交瘤细胞，需要用敏感、可靠、快速的方法测定，常用的有固相[[放射免疫测定法]]（RIA），酶免疫分析法(EIA)和[[免疫荧光]]法(IFA)等来检测上清中的微量抗体。

①固相放射免疫测定法：原理是抗原结合到固相载体的表面，并保持其[[免疫活性]]。若待测[[标本]]中存在对此抗原的特异性抗体，就会同吸附在载体表面的抗原结合，然后与[[放射性核素]]125Ⅰ标记的第二抗体一起孵[[温育]]，即可根据[[放射性]]强度，判读有无相应抗体的存在。本法敏感、简便、准确，是目前筛选杂交瘤抗体最常用的方法。②酶免疫分析法:常用的是间接法，原理是用[[酶标记]]的第二抗体筛选杂交瘤培养物上清中与抗原结合的抗体。此法的灵敏度和特异性与放射免疫测定法相似，但更简便、快速，显色反应可用肉眼鉴别，且酶标[[试剂]]比较稳定，是常用于初筛的方法。其缺点是某些细胞内有内源酶（如[[过氧化物酶]]），造成阴性对照[[本底]]较高，影响结果的判读。此外，用该法不易查到对一小群细胞（细胞[[亚群]]）起反应的抗体，此时可能将这种弱反映误认为本底而漏掉。③免疫荧光法：采用[[荧光色素]]标记第二抗体，用间接免疫荧光[[染色]]法检测活[[细胞膜]][[表面抗原]]的抗体。本法已广泛用于杂交瘤上清的筛选，能敏感地检出抗细胞亚群表面抗原的抗体。免疫荧光法的全过程可在96孔[[聚乙烯]]微量板中进行，结合运用荧光激活细胞分类仪(FACS)分离荧光染色阳性和荧光染色阴性的细胞。本法是大量、快速筛选分泌抗体的杂交瘤的有效方法，但因价格昂贵而不易推广。

===杂交瘤细胞的克隆化===

对阳性孔的杂交瘤细胞进行克隆化，是获得纯的克隆系的一个重要步骤。克隆化时应注意：①融合后，一旦抗体检测阳性，应立即进行克隆化，同时双份传代，液氮冻存。②融合后，待骨髓瘤细胞确已死亡，可将 HAT培养液换以HT培养液，初次克隆化时加HT。③应用有限稀释法进行克隆化时必须经过多次克隆（至少两次以上），才能基本保证杂交瘤细胞为单克隆。④克隆化后的杂交瘤细胞，在培养过程中有时也会发生变异或[[染色体丢失]]，失去产生特异性抗体的能力，因此需定期测定培养上清中抗体的[[滴度]]。若[[抗体滴度]]下降或转阴性时，则应复苏原始冻存的细胞管，进行培养检测，必要时应再克隆化和再冻存。

克隆化的方法为:①有限稀释法。本法简便易行，不需特殊设备，克隆效应高，故最常用。方法是将测得抗体阳性的杂交瘤细胞作[[连续稀释]]，稀释至每毫升含10个细胞或更少，按定量分种于含有饲养细胞层的96孔培养板中，直接观察孔里是否仅有一个[[细胞集落]]生长。在初次克隆化时，有的生长孔中只有一小部分有抗体活性，故应将阳性克隆细胞移至24孔培养板扩大培养，并冻存一部分细胞，及时进行再克隆，以提高抗体阳性克隆的百分率和保证杂交瘤细胞的单克隆化。②[[软琼脂培养]]法。将适当浓度的杂交瘤细胞加至软琼脂培养基中，使由一个细胞增殖的克隆形成一个集落，将细胞集落扩大增殖培养，测定[[上清液]]的抗体活力，若为阳性就可选出所需抗体的克隆。本法的优点是细胞融合后可直接进行克隆化，其缺点是克隆阳性率低，克隆化所需细胞浓度较高，因此所得单个细胞集落并不能绝对代表单个[[细胞克隆]]，常需进行再克隆化。

===杂交瘤细胞的增殖===

一旦杂交瘤细胞成功地克隆化，就可进行大量增殖以产生抗体。其方法有：①体外扩大培养法。刚获得的[[杂交瘤细胞系]]不能耐受稀释，因此培养物应逐渐扩大。先将96孔培养板中抗体阳性的细胞作1:3或1:5稀释，移至24孔培养板中孵育，再将其中抗体阳性的细胞扩大到25cm2[[培养瓶]]，然后转种至75cm2的大培养瓶中大量增殖，一般细胞培养上清的抗体含量可达5～50μg/ml。②动物接种。将杂交瘤细胞接种于同系小鼠皮下或腹腔内，约10天后，分别自[[血清]]或[[腹水]]中获取较大量的抗体。

===杂交瘤细胞的保存与[[复苏]]===

在杂交瘤培养过程中应尽早地将抗体阳性的杂交瘤细胞冻存起来，放入液氮中(-196℃)保存，以防因体外[[传代培养]]的[[细胞突变]]或因污染而丢失。

细胞复苏的方法是：从液氮中取出细胞管，立即放在37℃水浴中化冻，并立即用毛细吸管吸出细胞。放入培养液中[[离心]]，将沉淀的细胞悬于培养液中培养。

===单克隆抗体的提纯===

一般常用金黄色[[葡萄球菌]]蛋白A-[[琼脂糖]]4B亲和[[层析]]法。

===单克隆抗体的保存===

由腹水中获得的抗体，经离心去除[[细胞成分]]，再经[[冷冻]]超速离心，取上清液加0.1％NaN3，少量分装，冷冻于-70℃可保存几年。但应避免反复冻融，否则抗体[[失活]]，特别是[[IgM]]抗体。提纯的单克隆抗体，[[冷冻干燥]]保存于2～8℃，取出时溶解后，保存于2～8℃，至少一个月内可保持稳定。腹水抗体也可冷冻干燥[[低温]](4℃)保存两年，融化后放置4℃下保存一个月。短期使用的腹水抗体，4℃3～4 个月仍保持稳定，培养上清加0.1％NaN3，贮于-20℃，两年不失活性。

===单克隆抗体在临床上的应用===

单克隆抗体用于[[临床诊断]]和治疗，目前研究较多的是抗人 [[T细胞]]单克隆抗体，用以识别人T细胞表面的不同抗原决定簇，有OKT系统及Leu系统。T细胞，特别是[[免疫调节]]T细胞（Ti/h及Tc/s细胞）对于调控免疫应答和维持免疫自稳起着至关重要的作用，临床上许多疾病的发生与免疫调节失常有关，因此，研究 T细胞在这些疾病中的变化，有助于探讨病因和辅助诊断。各种免疫缺损病、[[肿瘤]]或[[感染性疾病]]都与[[免疫功能低下]]有关，而[[变态反应性疾病]]、[[自身免疫性疾病]]等与[[免疫功能]]亢进有关。因此应用 OKT系列单克隆抗体检测这些疾病患者外周血中T细胞亚群及[[T4]]/T8比值的变化，对探讨发病机理，及时诊断疾病及监测病情发展有十分重要的意义。接受[[肾移植]]或[[骨髓移植]]的患者往往需应用各种[[免疫抑制剂]]以控制排斥反应， T细胞亚群的检测有助于了解[[移植]]器官的排异和发展。

抗人 T细胞单克隆抗体可用以治疗白血病、[[移植物抗宿主反应]](GVHD)和急性肾排斥等，目前尚处于摸索阶段。

单克隆抗体技术 - 版本历史

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