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2014-01-26T10:38:04Z

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在[[分子]]水平上提供一种[[纯化]]和[[扩增]]特定DNA片段的方法。常含有目的[[基因]]，用体外[[重组]]方法将它们插入[[克隆载体]]，形成重组克隆载体，通过转化与[[转导]]的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。

克隆(clone,clon)一词源于希腊文Klon，原意为树木的枝条。在[[生物学]]中其名词含义系指一个[[细胞]]或个体以无性繁殖的方式产生一群细胞或一群个体，在不发生[[突变]]的情况下，具有完全相同的遗传性状，常称无性繁殖(细胞)系；其动词(clone,cloned,cloning)含义指在生物体外用重组技术将特定基因插入载体分子中，即[[分子克隆]]技术。

将DNA片段(或基因)与载体DNA分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目的可分为DNA和cDNA克隆两类。

cDNA克隆是以mRNA为原材料，经体外[[反转录]]合成互补的DNA(cDNA)，再与载体DNA分子连接引入寄主细胞。每一cDNA反映一种mRNA的结构，cDNA克隆的分布也反映了mRNA的分布。特点是：

①有些生物，如RNA[[病毒]]没有DNA，只能用cDNA克隆；

②cDNA克隆易筛选，因为cDNA库中不包含非[[结构基因]]的克隆，而且每一cDNA克隆只含一个mRNA的信息；

③cDNA能在[[细菌]]中表达。cDNA仅代表某一发育阶段表达出来的[[遗传信息]]，只有[[基因文库]]才包含一个生物的完整遗传信息。

1.方法：

(1)DNA片段的制备：常用以下方法获得DNA片段：①用[[限制性核酸内切酶]]将高分子量DNA切成一定大小的DNA片段；②用[[物理]]方法(如[[超声波]])取得DNA随机片段；③在已知[[蛋白质]]的[[氨基酸]]顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段；④从mRNA反转录产生cDNA。

(2)载体DNA的选择：

①[[质粒]]：质粒是细菌[[染色体]]外[[遗传因子]]，DNA呈环状，大小为1-200千[[碱基对]](kb)。在细胞中以游离[[超螺旋]]状存在，很容易制备。质粒DNA可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松弛型”。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个[[选择标记]]的特点。质粒型载体一般只能携带10kb以下的DNA片段，适用于构建[[原核生物]]基因文库，cDNA库和次级克隆。

②[[噬菌体]]DNA：常用的λ噬菌体的DNA是双链，长约49kb，约含50个基因，其中50%的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌体DNA两端。中间是非必需区，进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子。λ载体系统最适用于构建[[真核生物]]基因文库和cDNA库。

M13噬菌体是一种独特的载体系统，它只能侵袭具有F基因的[[大肠杆菌]]，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF)在寄主菌内是双链环状分子，象质粒一样自主制复，制备方法同质粒。寄主菌可分泌含[[单链]]DNA的M13噬菌体，又能方便地制备单链DNA，用于DNA顺序分析、定点突变和[[核酸]]杂交。

③拷斯(Cos)质粒：是一类带有噬菌体DNA[[粘性末端]]顺序的质粒DNA分子。是噬菌体－质粒混合物。此类载体分子容量大，可携带45kb的外源DNA片段。也能象一般质粒一样携带小片段DNA，直接转化寄主菌。这类载体常被用来构建高等生物基因文库。

(3)DNA片段与载体连接：DNA分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一，方法有：①粘性末端连接，DNA片段两端的[[互补碱基]]顺序称之为粘性末端，用同一种[[限制性内切酶]][[消化]]DNA可产生相同的粘性末端。在[[连接酶]]的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。②平头末端连接，用物理方法制备的DNA往往是平头末端，有些酶也可产生平头末端。平头DNA片段可在某些DNA连接酶作用下连接起来，但连接效率不如粘性末端高；③同聚[[寡核苷酸]]末端连接。④人工接头分子连接，在平头DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶[[识别位点]]的寡核苷酸片段，经限制性内切酶作用后就会产生粘性末端。

连接反应需注意载体DNA与DNA片段的比率。以λ或Cos质粒为载体时，形成线性多连体DNA分子，载体与DNA片段的比率高些为佳。以质粒为载体时，形成环状分子，比率常为1∶1。

(4)引入寄主细胞：常用两种方法：①转化或[[转染]]，方法是将[[重组质粒]]DNA或噬菌体DNA(M13)与[[氯化钙]]处理过的[[宿主]][[细胞混合]]置于冰上，待DNA被吸收后铺在平板[[培养基]]上，再根据[[实验设计]]使用[[选择性培养基]]筛选[[重组子]]，通常重组分子的转化效率比非重组DNA低，原因是连接效率不高，有许多DNA分子无转化能力，而且重组后的DNA分子比原载体DNA分子大，转化困难。②转导，病毒类侵染宿主菌的过程称为转导，一般转导的效率比转化高。

(5)克隆的选择：

①直接筛选：有些载体带有可辨认的[[遗传标记]]，能有效地将重组分子与[[本底]]区分。例如：有些λ噬菌体携带[[外源基因]]后形成的噬菌斑就会从原来的混浊变为清亮；还有些载体分子携带外源基因后，形成的[[菌落]]或噬菌斑的颜色有明显变化，如蓝色变为无色；有些λ噬菌体能侵染甲菌而不能侵染乙菌，携带外源DNA片段后便能侵染乙菌，因此乙菌释放的噬菌体均为重组分子。

②间接筛选：有引起载体分子带有一个或多个[[抗药性]][[标记基因]]，当外源DNA插入到[[抗药]][[基因区]]后，基因[[失活]]，抗性消失。如一质粒有A和B两个抗药性基因，当外源基因插入到B基因区后，便只抗A药而不抗B药。因此能在A药培养基上正常生长而不能在B药培养上生长的便是重组分子。

③核酸杂交：广泛用于筛选含有特异DNA顺序的克隆。方法是将菌落或噬菌斑“印迹”到[[硝酸纤维膜]]等支持物上，变性后固定在原位，然后与标记的核酸[[探针]]进行杂交。阳性点的位置就是所需要的克隆。

④[[免疫学]]方法：如果重组克隆能在宿主菌中表达，就可以用特异的蛋白质[[抗体]]为探针，进行[[原位杂交]]，选择特异的克隆。

2.重要意义与应用：

分子克隆技术是70年代才发展起来的，它的出现和应用开辟了[[分子遗传学]]研究的新领域，打开了人类了解、识别、分离和改造基因，创造新[[物种]]的大门。它的成就对于工业、农牧业和医学产生深远影响，并将为解决世界面临的能源、食品和环保三大危机开拓一条新的出路。

在医学方面，利用分子克隆技术已将[[胰岛素]]，人、牛和鸡的[[生长激素]]、人的[[干扰素]]、[[松弛素]]、促红细胞生长激素、[[乙型肝炎病毒]][[抗原]]和[[口蹄疫]]病毒抗原的基因制成工程菌，利用发酵工业进行了大规模生产。还可提高微生物本身所产生的[[蛋白酶]]类和[[抗生素类]]药物的产量。

在[[基因治疗]]方面。通过[[遗传工程]]看到癌细胞具有逆转为正常细胞的可能性，例如SV40病毒引起的小鼠[[肿瘤细胞]]，在温度高时可逆转为正常细胞。为治疗[[半乳糖血症]]，用带有大[[肠杆菌]][[乳糖]][[操纵子]]的λ噬菌体去[[感染]]半乳糖血症患者的离体培养细胞，发现这种细胞的[[半乳糖苷酶]]达到了正常水平，并确实能[[代谢]][[半乳糖]]。

在工业生产方面，以分子克隆技术为主体的[[基因工程]]、[[细胞工程]]、酶工程和发酵工程，四者紧密联系、常综合利用。许多[[化学]][[试剂]]如丙烯酸、[[己二酸]]、乙二醇、[[甲醇]]、[[环氧乙烷]]、[[乌头酸]]和[[水杨酸]]等都可能利用分子克隆技术得到产品。在环境保护方面，人们根据需要进行基因操作，将某种微生物的基因转入另一微生物，创造一些对有害物质降解能力更强的新菌种，以分解工业污水中的有毒物质。在食品工业方面，细菌可为人类生产有价值的蛋白质、氨基酸和糖等。

在农业生产方面，植物遗传工程对提高农作物的产量、培育新的农作物品种提供了可能。有许多外源基因导入植物获得成功。

分子克隆学的重要参考书：《分子克隆第三版》科学出版社

[[分类:克隆]][[分类:分子生物学]][[分类:生物工程]][[分类:遗传学]]

分子克隆 - 版本历史

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