112.247.109.102：以“凝集素（Lectin）是指一种从各种植物，无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红...”为内容创建页面

2014-01-27T05:07:32Z

以“凝集素（Lectin）是指一种从各种植物，无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红...”为内容创建页面

新页面

[[凝集素]]（Lectin）是指一种从各种植物，无[[脊椎动物]]和高等动物中提纯的[[糖蛋白]]或结合糖的[[蛋白]]，因其能[[凝集]]红血球（含[[血型物质]]），故名凝集素。常用的为[[植物凝集素]]（Phytoagglutin，PNA），通常以其被提取的植物命名，如[[刀豆素]]A（Conconvalina，ConA）、麦胚素（Wheat germ agglutinin，WGA）、[[花生凝集素]]（Peanut agglutinin，PNA）和[[大豆凝集素]]（Soybean agglutinin，SBA）等，凝集素是它们的总称。

==简介==
<b>凝集素(lectin)</b>

凝集素是[[动物细胞]]和植物细胞都能够合成和分泌的、能与糖结{{百科小图片|bk76s.jpg|[[木菠萝]]凝集素}}合的[[蛋白质]],在细胞识别和粘着反应中起重要作用,主要是促进[[细胞]]间的粘着。凝集素具有一个以上同糖结合的[[位点]]，因此能够参与细胞的识别和粘着,将不同的细胞联系起来。

凝集素（Lectin）是指一种从各种植物，无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红血球（含血型物质），故名凝集素。其常见种类见表6-1。常用的为植物凝集素（Phytoagglutin, PNA），通常以其被提取的植物命名，如刀豆素A（Conconvalina,ConA）、麦胚素（Wheat germ agglutinin, WGA）、花生凝集素（Peanut agglutinin, PNA）和大豆凝集素（Soybean agglutinin, SBA）等，凝集素是它们的总称。凝集素不是来源或参与[[免疫反应]]的产物，它们之所以被收入本书，是由于凝集素具有的某些“亲合”特性，能被[[免疫细胞化学]]技术方法所应用。因此，Ponder（1983）提出应称“凝集素[[组织化学]]”而不能称为“凝集素[[免疫]]组织化学”。　　
==凝集素的特性==
凝集素具有多方面的特性，在此我们仅简要提及其与免疫细胞化学技术方法应用有关的某些特性。我们知道，生物膜中含有一定量的糖类，主要以糖蛋白和[[糖脂]]的形式存{{百科小图片|bk76t.jpg|凝集素的标记技术}}在。凝集素最大的特点在于它们能识别糖蛋白和[[糖肽]]中，特别是[[细胞膜]]中复杂的碳水化合物结构，即细胞膜表面的碳脂[[化合物]][[决定簇]]。一种凝集素具有对某一种特异性[[糖基]][[专一性]]结合的能力，如刀豆素与α-D-[[吡喃糖]]基[[甘露糖]]（α-D-Mannopyranosy）结合；[[麦芽]]素与N-乙酰[[糖胺]]（N-acetyl glucosamine）结合；菜豆凝集素与N-乙酰[[乳糖]]胺结合（见本章　表6-1）。因此，凝集素可以作为一种[[探针]]来研究细胞膜上特定的糖基。另一方面，凝集素具有多价结合能力，能与[[荧光素]]、[[生物素]]、酶、[[胶体]]金和[[铁蛋白]]等[[示踪物]]结合，从而在光镜与/或电镜水平显示其结合部位。　　
==凝集素的应用==
一般认为细胞膜上特定的糖基可用以区别细胞的类型和反映细胞在[[分化]]、成熟和[[肿瘤细胞]]性变中的变化。仅在某些特殊的例子，其细胞结合凝集素的性能可以预先估计，如[[双花]][[扁豆]]素之于[[血型]]A物质的特异性，荆豆凝集素之于血型O物质2-L-[[岩藻糖]]的特异性，然而在绝大多数情况下，关于由凝集素所识别的碳水化合物决定簇的种类，关于携带决定簇的[[分子]]的性质和机能，完全凭实验经验去发现。　　
===作为[[细胞分化]]的标志===
作为细胞分化和成熟的标记应用凝集素作为细胞分化的标志，在这方面的应用报告最多，而且研究比较集中于[[血细胞]]，特别是[[淋巴细胞]]的[[分群]]。如Rose（1980）等发现在小鼠[[胸腺]][[皮质]]内不成熟的T淋巴细胞呈PNA阳性反应，在小鼠[[小肠]]集合淋巴小结的[[生发中心]]也发现有20%左右的PNA阳性反应细胞，后者是否属于不成熟的T淋巴细胞，是值得进一步研究的问题。Newman等（1979）以荧光素标记凝集素PNA，发现在[[大鼠]][[乳腺]][[上皮]]的不同分化时期显示不同的荧光强度。在不成熟的大鼠乳腺[[上皮细胞]]，荧光弱或无，随着[[性成熟]]期到[[妊娠期]]乳腺上皮荧光程度逐渐加强，而泌乳期荧光强度达最高峰。在[[皮肤]]角质细胞自基底向表层分化、成熟的过程中，[[细胞表面]]的碳水化合物的分布和性质都在改变。Brabed等（1981）应用新生大鼠皮肤的实验表明，皮肤各层细胞分别与不同的凝集素相结合。麦芽素与角质化细胞相结合，[[蓖麻]]素与[[棘细胞]]和基底细胞相结合，而荆豆凝集素标记在棘细胞的表面。在[[成肌细胞]]（myeoblast）的分化与成熟过程中，Winaod 和Luzzati（1975）注意到类似的皮肤的改变。　　
===作为细胞特殊类型的标记===
Kivela和Farkkanen（1987）发现在人[[视网膜]]，PNA标记[[视锥细胞]]而不标记[[视杆细胞]]。在乳腺、乳腺上皮细胞呈PNA阳性反应而[[肌上皮细胞]]和[[间质细胞]]呈PNA阴性反应。以多种凝集素对小鼠、大鼠和兔的肾[[组织切片]]进行[[染色]]结果表明，刀豆素A和蓖麻素存在于[[肾脏]]的各部，PNA和双花扁豆凝集素（DBA）主要分布于远曲小管和集合小管上皮细胞，荆豆凝集素（UEA）主要分布在[[血管]]内皮细胞，而麦芽素分布在[[肾小球]]。应用DBA对RIII和DDK品种的小鼠研究表明，DBA主要结合在各种组织内毛细血{{百科小图片|bk76u.jpg|凝集素}}管[[内皮细胞]]上，电镜观察显示DBA结合在内皮细胞的表面，在趣的是在RIII品系小鼠某些组织的内皮细胞显示肯定的DBA阴性反应，说明同一种属动物的血管内皮细胞也存在有组织特异性的差别。Streit和Kreutzberg（1987）发现Griffonia Simplicifolia凝集素特异性标记[[面神经]]节　内的[[小胶质细胞]]，其它类型的胶质细胞如星状胶质细胞（astrocyte）等都显示阴性反应。在切断面神经后，[[增殖]]的小胶质细胞对Griffonia Simplicifolia凝集素的反应加强，免疫电镜观察表明，凝集素主要沉积在细胞膜或小胶质细胞突起的[[轴膜]]表面，特异性结合糖基是α-D-[[半乳糖]]。上海医科大学附属[[肿瘤]]医院免疫病理室应用12种凝集素（表6-1）对人[[胚胎]]及各种正常组织进行了系统的凝集素[[受体]]的定位研究，结果表明，凝集素受体的分布并无即定规律可寻。如胃粘膜[[主细胞]]为PNA受体，而[[壁细胞]]为BSL受体，双花扁豆受体（DBA）主要出现在[[大肠]]部份。　　
===伴有细胞膜的改变===
在肿瘤中凝集素结合的改变肿瘤细胞伴有细胞膜的改变，细胞膜上的糖基也会产生相应的变化，可用凝集素检测出来。大量研究发现，凝集素可作为肿瘤组织源性的标记、肿瘤特异性诊断的标志、肿瘤恶性的标记和不同肿瘤的分化标记。如张华忠等（1987）报道115例[[胃癌]]标记PHA阳性率高达90.43%，而正常胃粘膜基本是阴性，故认为PHA是胃癌的诊断性标志。BSA对乳腺[[恶性肿瘤]]阳性率达79%，而对良性病变均呈阴性反应，提示BSA可能为乳腺恶性肿瘤的相关标志。凝集素还有助于判别肿瘤的组织类型，如神经系统[[星形细胞瘤]]ConA阳性，小胶质细胞瘤阴性，[[肾腺癌]]UEA1阴性，[[透明细胞]][[癌]]阳性。　　
==凝集素的分类==
凝集素可按糖的特异性、分子结构、结合位点和其功能进行分类。动物凝集素按分子结构分为C-型凝集素、S-型凝集素、P-型凝集素、I-型凝集素和Pentraxins。C-型凝集素是Ca2+依赖的凝集素；S-型凝集素是特异性识别β-[[半乳糖苷]]键的凝集素；P-型凝集素是特异性识别6[[磷酸甘露糖]]的凝集素；I-型凝集素是类似[[免疫球蛋白]]的凝集素；Pentraxins是有五个[[亚基]]的凝集素。　　
==[[化学]]应用==
凝集素可为荧光素、酶和生物素等所标记，分别进行下列染色法：　　
===直接法===
[[标记物]]直接标记在凝集素上，使之直接与切片中的相应糖蛋白或糖脂相结合。

（1）切片脱蜡至水。

（2）凝集素标记物（100μg/ml），室温，30min。

（3）TBS洗3次，每次min。

（4）如为荧光素标记物，封片用[[荧光显微镜]]观察。如为[[酶标记]]物，则应依次进行呈色、[[脱水]]、透明和封固后在光学显微下观察。

直接法的优点是简便，目前商品用的凝集素药盒已能购得。但灵敏性不够高。　　
===间接法===
将凝集素直接与切片中的相应糖基结合，而将标记物结合在抗凝集素{{百科小图片|bk76v.jpg|凝集素受体表达}}[[抗体]]上。

（1）脱蜡至水。

（2）用含3%的H2O2的[[甲醇]]阻断内源性[[过氧化物酶]]10min。

（3）凝集素[[稀释液]]（100μg/ml）孵育30min。

（4）TBS洗3次，每次min。

（5）用标记了的抗凝集素抗体（1：100）孵育30min。

（6）TBS洗3次，每次min。

（7）呈色、脱水、透明、封片。

（8）观察。

间接法染色还可进一步改良为：①三步法：即在凝集素孵育后，接着用抗凝集素抗体孵育，再用标记了的抗-抗凝集素抗体孵育，层层放大，进一步提高其敏感性，PAP[[复合物]]也可作为标记物标记在抗-抗凝集素抗体上。②[[抗生物]]素—生物素凝集素法：用结合了生物素的凝集素孵育切片后，TBS洗后再以抗生物素—标记物与之结合。间接法较直接法和直接法敏感性高5～10倍或更多一些，但必须购买或自制抗凝集素抗体。　　
===糖—凝集素—糖法===
本法是利用过量的凝集素与组织切片中特定的糖基相结合。经冲洗后，凝集素上还存在未被占用的结合部位，将这些部位与有过氧化物酶标记的特异性糖基相结合，形成一个明治样的糖—凝集素—糖的[[结合物]]。

（1）脱蜡至水。

（2）用含3%的H2O2的甲醇阻断内源性过氧化物酶10min。

（3）用100μg/ml的凝集素孵育30min。

（4）TBS洗3次，每次min。

（5）用100μg/mlHRP标记的糖液孵育30min。

（6）TBS洗3次，每次min。

（7）DAB呈色、脱水、透明、封固。

本法特异性强，灵敏度高，因为这不象生物素—抗生物素法那样要改变凝集素，又不需要像抗体那样要制备抗体。HRP本身含有甘露糖，能与[[刀豆]]凝集素A、扁豆凝集素和[[豌豆凝集素]]结合。但对其它的凝集素，本法目前普及还有一定困难，因为要将过氧化物酶结合到其它凝集素上，就需要将一个适当的碳水化合物基团嵌入过氧化物酶，称为[[糖基化]]（glycosylation），方法虽不复杂（Lee 等1976），但需一定的[[试剂]]和设备。商品化能提供的糖基化过氧化物酶品种尚有限。　　
==凝集素的性质==
至今在无脊椎动物体内发现的凝集素均是糖蛋白，糖以[[共价键]]形式结合进凝集素中，糖的种类主要包括有甘露糖、[[氨基葡萄糖]]、半乳糖，而少见[[木糖]]，[[阿拉伯糖]]。动物凝集素所含糖的种类和植物、微生物凝集素所含糖的种类不一样，凝集素中蛋白质部分主要由[[天冬氨酸]]、[[丝氨酸]]和[[苏氨酸]]组成，少见含硫[[氨基酸]]。与部分凝集素活性相关的[[金属离子]]常是Ca2+和Mg2+，这是许多糖进行结合或凝集活动所必需的。很多凝集素(如C一类型凝集素)发生凝集的一个必不可少的条件就是存在Ca2+ 。在赏凝集素(Limulin)中需要C扩+以类[[钙调素]]形式进行[[生理]]活动;而在Anthocidariscr assispina中，则是Ca2+ 影响凝集素分子[[构型]]:Ca2+影响[[牡蛎]]凝集素则是通过改变蛋白质构型，而不是直接参与[[配体]]结合。有人认为Ca2+ 通过离子键与梭基等作用，以稳定结构，增强氢键和疏水基团的相互作用。

凝集素进行的[[凝集反应]]常被单糖所抑制，有的却需某些[[二糖]]、[[三糖]]或[[多糖]]，被抑制的敏感性差别较大。某些典型特效凝集素易被相应血型物质中部分糖类所抑制，如A型血[[抗原]]特效的凝集素被N-乙酰-D一半乳糖所抑制;O型特效的凝集素被L一岩藻糖所抑制。凝集素结合糖类的专一性范围不一。少数凝集素的结合范围相当窄。用[[蛋白酶]]，如[[胰蛋白酶]]、[[链霉蛋白酶]]等温和处理凝集素，可使其凝集活动的敏感性得到提高，一些添加剂、金属离子也影响凝集素活动。　　
==研究凝集素的意义==
凝集素在动、[[植物体]]内广泛存在。凝集素最大的特点是能识别糖蛋白和糖脂中，特别是细胞膜中复杂的碳水化合物结构，即细胞膜表面的糖基。一种凝集素具有只对某一种特异性糖基专一性结合的能力。因此，凝集素可以作为研究细胞膜结构的探针。凝集素在无脊椎动物[[血液]]中具有多种生物活性，可以选择凝集各种细胞，对肿瘤细胞有特异性[[凝集作用]]等，是[[免疫防御]]的重要体液因子之一。另一方面，凝集素具有多价结合能力，能与荧光素、酶、生物素、铁蛋白及胶体金等结合、而不影响其生物活性，可用于光镜或电镜水平的免疫细胞化学研究工作，在探索细胞分化、[[增生]]和恶变的[[生物学]]演变过程，显示[[肿瘤相关抗原]]物质，以及对肿瘤的诊断评价等方面均有一定的价值。此外，植物凝集素在植物体内也具有相当重要的作用，如在种子萌发过程中的作用；作为植物[[胚细胞]]的促[[有丝分裂因子]]；在作物害虫防治方面表现出的保护功能等等。研究凝集素的特异性有助于以分子或原子层次 (Molecular or atomic level) 了解生命现象或[[病理]]变化。　　
==注意事项==
①凝集素需要重金属离子维持其活跃的结合部位，如果金属离子耗尽了，

就会影响凝集素的结合能力。因此，有作者主张用TBS作为[[缓冲液]]，内加微量的金属，配方是：Tris 60.57g，NaCl87g，H2O加至1000ml，其中含CaCl2、MgCl2各1.0mmol/L。或在进入凝集素孵育前，先用该液孵育，以增强凝集素结合力。 ②和其它抗体[[血清]]应用一样，应用每批新的凝集素实验时，都先要用缓冲液稀释成不同等级；如8，16，32，64，125，250，500，1000μg/ml，经染色选择最佳稀释度。

③有作者认为阻断组织内源性过氧化物酶所用的H2O2对碳水化合物有影响，可能改变凝集素的结合形式，因此，应尽量少用或不用，我们及一些作者在实验过程中发现影响不明显。

④有作者认为凡经固定的组织切片，不论是[[石蜡]]包埋切片或冰冻切片，都有可能使组织中抗原隐蔽，为了暴露隐蔽了的碳水化合物基团，主张在凝集素孵育前用酶处理切片，常用胰蛋白酶液（配制见附表）进行适当的孵育。

⑤已知哺乳动物的[[质膜]]含有占蛋白总量的1%～10%的碳水化合物，它们以[[低聚糖]]（oligosacchride）糖脂，并主要以糖蛋白的形式存在，糖蛋白线性的或分支的旁链可能含有两个到多个单糖[[残基]]，通常有两种或更多的单糖，在单糖单位末端常常是一个带负电荷的N-乙酰[[神经氨酸]]的残基，一个[[唾液酸]]（siallic acid）。有作者在凝集素实验中常用[[神经氨酸酶]](neuramidinase)分解细胞表面的唾液酸或神经氨酸，以暴露出隐蔽的能与聚集素结合的次终末的碳水化合物。配制方法是将神经氨酸酶（Type V，Sigma Lot 63F-8172 63F-8172）用[[醋酸]]缓冲液（含2%[[牛血清]][[白蛋白]]）BSA配成0.5μg/ml。

切片脱蜡后进行酶[[消化]]的过程中，将该组织切片置于上述配制液中，在湿盒内，37℃孵育30min。用缓冲液洗后，进行凝集素染色。

⑥对照试验，和其它组化染色一样，凝集素染色也需要设对照试验（最好在相邻切片进行）。由于凝集素具有单糖特异性，如果外加相应的糖，把凝集素的结合部位占有了，凝集素就不能再与组织中的糖基相结合了。一般采用的方法是将凝集素预先与相应的糖（0.2mol/L）在室温孵育30min，使之占有凝集素结合部位，再将此液代替凝集素进行孵育，结果应为阴性。在某些情况下即使提高糖液的浓度也不能达到完全的抑制。这时，只有用与凝集素有高[[亲合力]]的低聚糖（oligosachrides）代替或将切片预先用相应的[[糖苷酶]]孵育去除特异性糖基（Watanalte等，1981）。　　
==抗体制备==
1．HRP标记凝集素法适用于小量的凝集素标记（Ponder 1983）。（1）HRP的[[活化]]

①将10mg HRP(SigmaType VI)溶解在1ml 0.3mol/L 的[[重碳酸钠]]溶液中（1.25g/50ml）。

②加50μl含1%[[氟二硝基苯]]的[[无水乙醇]]溶液，室温轻度搅拌1h。

③加1ml含0.06mol/L的[[过碘酸]]钠的[[蒸馏水]]（0.62g/50ml），室温下轻度搅拌30min。

④在室温下加两滴0.16mol/L乙二醇，轻搅1h。

⑤用Sephadex G-25装成小柱，用0.3mol/L的重碳酸钠溶液，使含HRP的混合液过柱。

（2）结合

①正常条件下，可用凝集素及过氧化物酶各半量，但其比例可根据需要调整，以10mg凝集素溶解在25ml的重碳酸盐缓冲液里，加到“活化”的HRP中去，这样得出的凝集素浓度大约是0.3mg/ml，可加进0.1mol/L相应的特异的糖，以保护凝集素结合时的结合部位。糖在下步[[透析]]或层析时去掉。

②在室温下轻搅拌，结合3h。

③加入1mg硼[[氢化钠]]，室温下作用1h以稳定结合物活性。

④用1N HCl调整pH至6.4，留置室温下过夜。

（3）[[纯化]]

①用适当的[[凝胶层析]]柱如SephadexG—200、Saphacryl—300层[[析法]]将游离的凝集素、游离的过氧化物酶和高分子量的成分从结合物分离出去，包括抑制性的糖也在此时分离出去。

②提纯后的结合物在280nm和403nm波长处测量其吸光率。用1%BSA先通过0.22μm的[[微孔过滤]]器，以确定被结合的凝集素是否被吸附在滤器中，然后上述结合物经过该微孔滤过器过滤到一个[[无菌]]瓶中。

③加入[[叠氮]]钠，浓度1：1000，保存于4℃C备用。

2．抗凝集素抗体的制备抗凝集素抗体的制备法与一般[[免疫血清]]制备大致相同。所不同的是：①凝集素具有较强的[[毒性]]，易使被免疫动物发病或甚至死亡。解决的方法是经处理使凝集素变性，从而减低其毒性，但同时要保证其[[抗原性]]不受或少受破坏。②要设法阻断凝集素的糖结合部位，以减少对这些部位的抗体的产生，解决的办法是预先以相应的糖阻断这些结合部位。Leathem 和Atkin（1982）设计了一个办法，他们首先应用[[琼脂糖]]（Sepharose）珠，珠上有一系列共价糖的附着，这些糖可阻断凝集素结合部位，这种糖珠有商品供应（Sigma LtD），每1ml糖珠能结合大约12mg凝集素。其次用加入福尔马林和加热的方法使凝集素变性，毒性减低而不影响抗原性。具体操作如下：

①1ml琼脂糖—半乳糖珠与1mg花生凝集素相结合，室温1h。

②加入10ml 10%福尔马林，在水浴中加热到60℃，1h。

③用盐水离心洗珠，将珠分成以10μl为单位的若干小份，保存在-20℃。

④皮下多处注射两只家兔[[背部]]，每次注射100μl，每隔三周注射一次。取血40～50ml，保存在-20℃备用。

[[分类:生物]][[分类:化学]][[分类:细胞]][[分类:蛋白质]]

凝集素 - 版本历史

112.247.109.102：以“凝集素（Lectin）是指一种从各种植物，无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红...”为内容创建页面