112.247.109.102：以“diāo wánɡ 凋亡谓大量减少。《陈书.世祖纪》：“自丧乱以来，十有馀载，编户凋亡，万不遗一，中原氓庶，盖云无几。...”为内容创建页面

2014-01-26T11:47:00Z

以“diāo wánɡ 凋亡谓大量减少。《陈书.世祖纪》：“自丧乱以来，十有馀载，编户凋亡，万不遗一，中原氓庶，盖云无几。...”为内容创建页面

新页面

diāo wánɡ

[[凋亡]]

谓大量减少。《陈书.世祖纪》：“自丧乱以来，十有馀载，编户凋亡，万不遗一，中原氓庶，盖云无几。”　　
==2）[[分子]][[生物学]]原理==
也称为“固缩[[坏死]]”、“[[程序性细胞死亡]]”或“[[细胞]][[自杀]]”，是由[[基因]]介导的一系列变化，细胞依靠它来主动地引起它自身的破坏。正常起消除老化细胞或未参与[[免疫反应]]的[[淋巴细胞]]的凋亡过程，如发生[[病理]]性干扰，可对[[肿瘤生成]]起作用。凋亡最初由特征性的形态变化来确定，包括：DNA的程序性降解、[[染色质]]浓缩、细胞缩小和碎裂。它可以是[[生理]]性的，或由[[化疗药物]]及放射诱发（来自希腊文，apoptosis,描写深秋枯叶从涂写上掉落的现象）。

是一种细胞受环境刺激后，在基因调控之下所产生的自然死亡现象，在这一机制下，失去作用或已经受损的细胞会自我毁灭。细胞发生[[变异]]的癌细胞就是因为关闭了细胞内[[线粒体]]的这一调控功能，所以才躲过这一调控机制，不会自我毁灭。

[[细胞凋亡]]检测

1、

早期检测:

1) PS([[磷脂酰丝氨酸]])在细胞[[外膜]]上的检测

2)细胞内[[氧化还原状态]]改变的检测

3)[[细胞色素C]]的定位检测

4) 线粒体[[膜电位]]变化的检测

2、

[[晚期]]检测：

细胞凋亡晚期中，[[核酸内切酶]]在[[核小体]]之间剪切核DNA，产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段。

对于晚期检测通常有以下方法：

1) TUNEL(末端[[脱氧核苷]]酸[[转移酶]]介导的dUTP缺口[[末端标记]])

2) LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测)

3) Telemerase Detection ([[端粒酶]]检测)

3、[[生化]]检测：

1）典型的生化特征：DNA 片段化

2）检测方法主要有：[[琼脂糖凝胶电泳]]、原位末端标记（TUNEL）等

3）TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记）

4）通过DNA[[末端转移酶]]将带标记的 dNTP （多为dUTP）间接或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。可做细胞悬液、福尔马林固定或[[石蜡]]处理的组织、[[细胞培养]]物等多种样本的检测。

4、LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测)

当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体[[组织切片]]）时，直接[[琼脂糖]]电泳可能观察不到核DNA的变化。通过LM-PCR,连上特异性接头，[[专一性]]地[[扩增]]梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段。此外，LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖[[核苷酸]]末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和[[放射自显影]]，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。

上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征，但细胞受到其它损伤（如机械损伤，[[紫外线]]等）也会产生这一现象，因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰。需结合其它的方法来检测细胞凋亡。花开花谢，似水流年……

其它方法：

1）Telemerase Detection (端粒酶检测)

端粒酶是由RNA和[[蛋白]]组成，它可以自身RNA为模板[[逆转录]]合成[[端粒]]区[[重复序列]]，使细胞获得“永生化”。正常[[体细胞]]是没有端粒酶活性的，每分裂一次，[[染色体]]的端粒会缩短，这可能作为[[有丝分裂]]的一种时钟，表明细胞年龄、复制[[衰老]]或细胞凋亡的信号。研究发现，90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性。

2）mRNA水平的检测

研究者们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因，检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法。据报道，Fas 蛋白结合[[受体]]后能诱导癌细胞中的[[细胞毒性]]T细胞（cytotoxic T cells）等[[靶细胞]]。Bcl-2 和bcl-X (长的) 作为抗凋亡（bcl-2 和bcl-X）的[[调节物]]，它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活。用荧光定量PCR技术来检测[[基因表达]]水平无疑比之前者更快更准确。通过检测fas, bax-alpha 和 bcl-X (长的) 基因的 mRNA表达水平来进行细胞凋亡的检测。

5、细胞内氧化还原状态改变的检测：

正常状态下,谷光苷[[肽]](GSH)作为细胞的一种重要的[[氧化还原]]缓冲剂。细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH[[还原酶]]迅速还原。这一反应在线粒体中尤为重要，许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除。当细胞内GSH的排除非常活跃时，[[细胞液]]就由还原环境转为氧化环境，这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低，从而使细胞色素C（[[三羧酸循环]]中的重要组分）从线粒体内转移到细胞液中，启动凋亡[[效应器]]caspase的[[级联反应]]。花开花谢，似水流年……

6、细胞色素C的定位检测

细胞色素C作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下，它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至[[细胞浆]]，结合Apaf-1 （apoptotic protease activating factor-1）后启动caspase级联反应：细胞色素C/Apaf-1[[复合物]]激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。

7、线粒体膜电位变化的检测：

1）线粒体跨膜电位的耗散与细胞凋亡有密切关系

2）近年来陆续有报道说明线粒体跨膜电位的耗散早于[[核酸酶]]的激活，也早于磷酯酰[[丝氨酸]]暴露于[[细胞表面]]。而一旦线粒体跨膜电位耗散，细胞就会进入不可逆的凋亡过程。

3）在细胞凋亡过程中线粒体跨膜电位的耗散主要是由于线粒体内膜的通透性转变，这是由于生成了动态的由多个[[蛋白质组]]成的位于线粒体内膜与外膜接触[[位点]]的通透性转变孔道(PT孔道)能稳定线粒体跨膜电位就能防止细胞凋亡。

线粒体在细胞凋亡作用中的进一步证据：

1）若将[[纯化]]的正常的线粒体与纯化的[[细胞核]]在一起保温，并不导致细胞核的变化。但若将诱导生成PT孔道的线粒体与纯化的细胞核一同保温，细胞核即开始凋亡变化。

2）形态学观察，看到细胞数目有限，统计学上的准确性受影响；

3）[[凝胶电泳]]检测DNA破坏了细胞的完整性也不能测出凋亡细胞占总细胞的比例；

4）流式细胞术可检测细胞、亚细胞及分子水平的特征性变化。

用于[[流式细胞仪]]检测的染料：

PI、Hoechst、 EB、 DAPI、丫啶橙等，其中PI、Hoechst最常用。

PI和Hoechst33342双标：

PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。但是PI不能通过正常的[[细胞膜]]，Hoechst则为膜通透性的[[荧光染料]]，故细胞在处于坏死或晚期凋亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。正常细胞和中早期凋亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡蓝色，内有较深的蓝色颗粒；而凋亡细胞的核由于浓集而呈亮蓝色，或核呈分叶，碎片状，边集。

故PI着色为坏死细胞；亮蓝色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为凋亡细胞。

PI和Annexin-V双标：

磷脂酰丝氨酸（PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期（或细胞损伤时）PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。

Annexin-V（green）可以和磷脂酰丝氨酸（PS）特异性结合。因此细胞处于凋亡或坏死时，Annexin-V可为阳性（早期的坏死细胞可能为阴性）。但是只有坏死的细胞PI是阳性。

五、形态学观察

1、普通[[光学显微镜]]观察

2、透射[[电子显微镜]]观察

3、[[荧光显微镜]]观察

1、普通光镜下观察：

1)用[[苏木]]素-[[伊红]]（HE）[[染色]]：细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色（凋亡细胞），正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色，坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失

2)Giemsa染色法、瑞氏染色法等，正常细胞核的色泽均一，凋亡细胞染色变深，坏死细胞染色浅或没染上颜色

直接用[[倒置显微镜]]观察：

1）细胞体积变小，全面皱缩；

2）[[凋亡小体]]为数个圆形小体围绕在细胞周围。

2、透射电子显微镜观察

凋亡细胞体积变小，[[细胞质]]浓缩。

细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状或呈折缝样，部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

3、荧光显微镜

常用的荧光染料：丫啶橙、 PI 、DAPI、Hoechst33258 和Hoechst33342、EB等

Hoechst 33342、Hoechst 33258、 DAPI三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T[[碱基]]区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。

1）PI双染色法基本原理

Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，能进入正常细胞膜而对细胞没有太大得[[细胞毒]]作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。

DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。

碘化丙啶(PI)是一种[[核酸]]染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而将细胞核染红。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

注意事项：细胞凋亡时，其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一，但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低，或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结果时应该注意。

六、细胞凋亡的分子生物学检测方法:

细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸[[水解酶]]的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca &sup2;+和Mg&sup2;+依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA[[多聚体]]。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和[[荧光素]]、[[过氧化物酶]]、碱性磷酸化酶或[[生物素]]形成的[[衍生物]]标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。由于正常的或正在[[增殖]]的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。[[低分子量]]的DNA分离后，也可使用DNA[[聚合酶]]进行缺口翻译（nick translation），使低分子量的DNA标记或染色，然后分析凋亡细胞。TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的[[组织化学]]和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。

过氧化物酶标记测定法

原理：脱氧核糖核苷酸衍生物[[地高辛]]［（digoxigenin）-11-dUTP］在TdT酶的作用下，可以掺入到凋亡细胞双链或[[单链]]DNA的3-OH末端，与dATP形成异多聚体，并可与连接了报告酶（过氧化物酶或[[碱性磷酸酶]]）的抗地高辛[[抗体]]结合。在适合[[底物]]存在下，过氧化物酶可产生很强的颜色反应，特异准确的定位出正在凋亡的细胞，因而可在普通光学显微镜下进行观察。

[[毛地黄]]植物是地高辛的唯一来源。在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的[[配体]]，因而非特异性反应很低。抗地高辛的[[特异性抗体]]与[[脊椎动物]][[甾体激素]]的[[交叉反应]]不到1％，若此抗体的Fc部分通过[[蛋白酶]]水解的方法除去后，则可完全排除细胞Fc受体非特异性的吸附作用。

本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培养的或从组织中分离的细胞凋亡测定。

(一)[[试剂]]配制

1、[[磷酸]][[缓冲液]]PBS（pH7.4）：[[磷酸钠盐]] 50mM，NaCl 200mM。

2、蛋白酶K（200μg/ml，pH7.4）：蛋白酶K 0.02g；PBS 100ml。

3、含2%H2O2的PBS缓冲液（pH7.4）：H2O2 2.0ml；PBS缓冲液 98.0ml。

4、TdT酶缓冲液（新鲜配）：Trlzma碱 3.63g用 0.1N HCl调节pH至 7.2，加ddH2O定容到1000ml；再加入二甲砷酸钠 29．96g和[[氯化钴]]0.238g。

5、TdT[[酶反应]]液：TdT酶32μl；TdT酶缓冲液 76μl，混匀，置于冰上备用。

6、洗涤与终止反应缓冲液：[[氯化钠]] 17. 4g；[[柠檬酸钠]] 8.82g；ddH2O 1000ml

7、0.05％[[二氨基联苯]]（DAB）溶液：DAB 5mg；PBS 10ml，pH7.4, 临用前过滤后，加[[过氧化氢]]至0.02%。

8、0.5％[[甲基绿]]（pH4.0）：甲基绿0.5g；0.1M[[乙酸]]钠100ml。

9、100％[[丁醇]]，100％、95％、90％、80％和70％[[乙醇]]，[[二甲苯]]，10％中性[[甲醛溶液]]，乙酸，[[松香]]水等。

10、

过氧化物酶标记的抗地高辛抗体（ONCOR）

（二）实验步骤

1、[[标本]][[预处理]]：

（1）石蜡包埋的组织切片预处理：将组织切片置于[[染色缸]]中，用二甲苯洗两次，每次min。用[[无水乙醇]]洗两次，每次min。用95％和75％乙醇各洗一次，每次min。用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液（20ug／ml），于室温水解15min，去除组织蛋白。用[[蒸馏水]]洗4次，每次min，然后按下述步骤2进行操作。

（2）冰冻组织切片预处理：将冰冻组织切片置10％中性[[甲醛]]中，于室温固定10min后，去除多余液体。用PBS洗两次，每次min。置乙醇：乙酸（2：1）的溶液中，于-20℃处理5min，去除多余液体。用PBS洗两次，每次min，然后按下述步骤2进行操作。

（3）培养的或从组织分离的细胞的预处理：将约 5 × 107个/ml细胞于 4％中性甲醛室温中固定 10min。在[[载玻片]]上滴加 50～100μl细胞悬液并使之干燥。用PBS洗两次，每次min，然后按下述步骤2进行操作。

2、色缸中加入含2％过氧化氢的PBS，于室温反应5min。用PBS洗两次，每次min。

3、用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，立即在切片上加2滴 TdT酶缓冲液，置室温1～5min。

4、

用滤纸小心吸去切片周围的多余液体，立即在切片上滴加 54μl TdT酶反应液，置湿盒中于37C反应 1hr（注意：阴性染色对照，加不含TdT酶的反应液）。

5、将切片置于染色缸中，加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液，于37℃保温30min，每10min将载玻片轻轻提起和放下一次，使液体轻微搅动。

6、

组织切片用PBS洗 3次，每次 5min后，直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，于湿盒中室温反应30min。

7、用PBS洗4次，每次min。

8、在组织切片上直接滴加新鲜配制的0.05％DAB溶液，室温显色3～6min。

9、用蒸馏水洗4次，前3次每次min，最后1次min。

10、

于室温用甲基绿进行[[复染]]10min。用蒸馏水洗3次，前两次将载玻片提起放下10次，最后1次静置30s。依同样方法再用100％[[正丁醇]]洗三次。

11、

用二甲苯[[脱水]]3次，每次min，封片、干燥后，在光学显微镜下观察并记录实验结果。

（三）注意事项

一定要设立阳性和阴性细胞对照。阳性对照的切片可使用DNaseI部分降解的标本，阳性细胞对照可使用[[地塞米松]]（1μM）处理3-4hr的大、小鼠[[胸腺细胞]]或人外周[[血淋]]巴细胞。阴性对照不加TdT酶，其余步骤与[[实验组]]相同。

细胞产生不可修复的DNA损伤后通常会程序性死亡，或称凋亡。然而在[[肿瘤细胞]]中这一机制失去作用，所以它能够肆意增殖，拒绝接受“自杀”的命令。德国科学家近日发现了其中的可能原因——肿瘤细胞会降解一种能触发凋亡的蛋白。抑制这种蛋白的降解能够使凋亡机制恢复作用，并将提升放疗和[[化疗]]的效力。相关论文发表在《自然—[[细胞生物学]]》（Nature Cell Biology）上。

严重DNA损伤后触发凋亡的其中一类蛋白是HIPK2分子。德国[[癌症]]研究中心的Thomas Hofmann和同事研究发现，HIPK2不断在健康细胞中产生，但一种名为Siah-1的酶将它标记为“垃圾”，所以它又立刻被降解。

轻微损伤的细胞会进入一种低级警戒状态——短时间内抑制HIPK2的降解。一旦损伤得到修复，细胞会立即恢复对HIPK2的降解。只有在严重损伤（比如DNA双链均遭破坏）的细胞中，HIPK2的降解才被永久性地抑制。结果HIPK2不断积累，触发凋亡，细胞自杀。

研究人员推测，这可能就是放疗和化疗有时失效的原因。这两种治疗方法都会严重损伤肿瘤细胞，最终导致它们的程序性死亡。Thomas Hofmann说：“如果有抵抗发生，经常是由于肿瘤细胞‘拒绝’执行自杀的命令。”

研究人员在实验中抑制了Siah-1酶，结果发现，即使在轻微损伤的细胞中，HIPK2也能够积聚，凋亡也被触发。Hofmann推测，“[[癌]]医学将可能利用这一发现。比如，我们可以将Siah-1[[抑制剂]]与放疗或化疗结合使用，从而将细胞拉回到凋亡机制中来。

[[分类:生物]][[分类:分子]][[分类:细胞]][[分类:发育]]

凋亡 - 版本历史

112.247.109.102：以“diāo wánɡ 凋亡 谓大量减少。《陈书.世祖纪》：“自丧乱以来，十有馀载，编户凋亡，万不遗一，中原氓庶，盖云无几。...”为内容创建页面

112.247.109.102：以“diāo wánɡ 凋亡谓大量减少。《陈书.世祖纪》：“自丧乱以来，十有馀载，编户凋亡，万不遗一，中原氓庶，盖云无几。...”为内容创建页面