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2014-02-05T06:41:20Z

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'''内切酶'''（incision enzyme），即[[限制性核酸内切酶]]。亦称限制性核酸酶。这是一类能从DNA[[分子]]中间水解[[磷酸二酯键]],从而切断双链DNA的[[核酸]][[水解酶]]。它们不同于一般的[[脱氧核糖核酸酶]]（DNase）,它们的切点大多很严格，要求专一的[[核苷酸]]顺序{{百科小图片|bkebt.jpg|}}——识别顺序。长期以来，难以深入研究的DNA大分子,借此可以切割成特定的小片段来分析。限制性核酸酶的发现,为[[基因]]结构、DNA[[碱基顺序]]分析和[[基因工程]]的研究开辟了途径。为此，W.阿尔伯，H.史密斯和D.内森斯三人共同获得了1978年诺贝尔生理学或医学奖。

一种能[[催化]][[多核苷酸]]的链断裂的酶，只对[[脱氧核糖核酸]]内一定[[碱基]]序列中某一定位置发生作用，把这位置的链切开。通过<b>内切酶</b>可以把某一个遗传基因切下来，若再连在别的[[细胞]]的遗传基因上，便可使这细胞具有新的遗传特性。内切酶的发现和采用，使基因工程成为可能。　　
==内切酶的分类==
内切酶主要分成三大类。第一类内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有[[专一性]]，是随机的。这类[[限制性内切酶]]在DNA[[重组]]技术或基因工程中没有多大用处，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。

第二类内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。所以总能得到同样核苷酸顺序的DNA片段，并能构建来自不同[[基因组]]的DNA片段，形成杂合DNA分子。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、9个、10个和11个核苷酸的。如果识别位置在DNA分子中分布是随机的，则识别4个核苷酸的限制性内切酶每隔46（4096）个核苷酸就有一个切点。人的[[单倍体]]基因组据估计为3×199核苷酸，识别4个核苷酸的限制性内切酶的切点将有（3×109/2.5×102）约107个切点，也就是可被这种酶切成107片段，识别6个核苷酸的限制性内切酶也将有（3×109/4×103）约106个切点。

第二类内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个向“读”都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式。一是交错切割，结果形成两条[[单链]]末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为[[粘性末端]]。如EcoRI的识别顺序为：

↓ ｜

5’……GAA ｜ TTC……3’

3’……CTT ｜ AAG……5’

｜ ↑

垂直虚线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG，这就是回文顺序（palindrome）。实线剪头表示在双链上交错切割的位置，切割后生成5’……G和AATTC……3’、3’……CTTAA和G……5’二个DNA片段，各有一个单链末端，二条单链是互补的，可通过形成氢键而“粘合”。另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如HaeⅢ的识别位置是：

↓

5’……GG↓CC……3’

3’……CC↓GG……’

↑

在箭头所指处切割，产生的两个DNA片段是：

5’……GG CC……3’

和

3’……CC GG……5’

有时候两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，差别只在于当识别顺序中有[[甲基化]]的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如HpaⅡ和MspⅠ的识别顺序都是5’……GCGG……3’，如果其中有5’-[[甲基胞嘧啶]]，则只有HpaⅡ能够切割。这些有相同切点的酶称为同切酶或[[异源同工酶]]（isoschizomer）。

第三类内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。它在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则是任意的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。这对于克隆基因或克隆DNA片段没有多大用处。　　
==内切酶用于克隆PCR==
克隆PCR产物的方法之一，是在PCR产物两端设计一定的[[限制酶切]][[位点]]，经酶切后克隆至用相同酶切的载体中。但实验证明，大多数[[限制酶]]对裸露的[[酶切位点]]不能切断。必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对其[[识别位点]]进行有效切断。

酶切位点（内切酶的识别序列）要加在[[引物]]的5'端，为保证PCR产物能被限制性内切酶的识别且有效的酶切，一般在引物的5'端酶切位点侧边加上保护碱基。

具体为：5'-保护碱基＋酶切位点＋引物序列-3'

详细可参见，如下图：

[[分类:生物化学]][[分类:基因]][[分类:细胞生物学]][[分类:遗传学]]

内切酶 - 版本历史

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