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2014-01-26T08:26:15Z

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[[免疫印迹法]] (Western blotting) 是一种将高分辨率[[凝胶电泳]]和[[免疫化学]]分析技术相结合的杂交技术。免疫印迹法具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点，是检测[[蛋白质]]特性、表达与分布的一种最常用的方法，如组织[[抗原]]的定性定量检测、[[多肽]][[分子]]的质量测定及[[病毒]]的[[抗体]]或抗原检测等。

免疫印迹法(immunobiotting test,IBT)亦称[[酶联免疫]]电转移印斑法(enzyme linked

immunoelectrotransfer blot,EITB),因与Southern早先建立的检测[[核酸]]的印迹方法 Southern

blot 相类似,亦被称为Western-blot.

免疫印迹法分三个阶段进行.第一阶段为SDS-[[聚丙烯酰胺凝胶电泳]](SDS-PAGE):抗原等[[蛋白]]

样品经SDS处理后带阴电荷,在[[聚丙烯酰胺凝胶]]中从阴极向阳极泳动,分子量越小,泳动速度就越

快.此阶段分离效果肉眼不可见(只有在[[染色]]后才显出电泳区带).第二阶段为电转移:将在[[凝胶]]

中已经分离的条带转移至[[硝酸]]纤维素膜上,选用低电压(100V)和大电流(1～2A),通电45min

转移即可完成.此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见.第三阶段为酶免疫定位:将印有蛋白质条

带的硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)依次与[[特异性抗体]]和酶标第二抗体作用后,加

入能形成不溶性显色物的[[酶反应]][[底物]],使区带染色.常用的HRP底物为3,3'-[[二氨基联苯胺]](呈

棕色)和4-氯-1-[[萘酚]](呈蓝紫色).阳性反应的条带清晰可辨,并可根据SDS-PAGE时加入的分子

量标准,确定各组分的分子量.本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性,

是一个有效的分析手段,不仅广泛应用于分析抗原组分及其[[免疫活性]],并可用于[[疾病]]的诊断.在艾

滋病[[病毒感染]]中此法作为确诊试验.抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后,将膜切成小条,配合酶

标抗体及显色底物制成的[[试剂盒]],可方便地在实验室中供检测用.根据出现显色线条的位置可判断

有无针对病毒的特异性抗体.　　
===免疫印迹法===
免疫印迹法是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新[[基因]]的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

一、原理

与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“[[探针]]”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非[[共价键]]形式[[吸附蛋白]]质，且能保持电泳分离的多肽类型及其[[生物学]]活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起[[免疫反应]]，再与酶或[[同位素标记]]的第二抗体起反应，经过底物显色或[[放射自显影]]以检测电泳分离的特异性目的[[基因表达]]的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

二、[[试剂]]准备

1、SDS-PAGE试剂:见电泳实验。

2、[[匀浆]][[缓冲液]]：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml；10%SDS 6.0ml；β-[[巯基]][[乙醇]] 0.2ml；ddH2O 2.8ml。

3、转膜缓冲液：[[甘氨酸]] 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；[[甲醇]]200ml；加ddH2O定容至1000ml。

4、0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加ddH2O至1000ml。

5、膜[[染色液]]：考马斯[[亮兰]] 0.2g；甲醇80ml；[[乙酸]]2ml；ddH2O118 ml。包被液（5%[[脱脂]]奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。

6、显色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；[[硫酸]]镍胺 0.1ml；H202 1.0μl。

三、操作步骤

（一）蛋白质样品获得：[[细菌]]诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解[[细胞]]，[[真核细胞]]加匀浆缓冲液，机械或[[超声波]]室温匀浆0.5-1min。然后4℃，13,000g离心15min。取[[上清液]]作为样品。

（二）电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。

（三）转移：（半干式转移）

1、电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。

2、膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。

3、转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.5hr。转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做[[免疫]]印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。

（四）免疫反应：

1、用0.01M PBS洗膜，5min ×3次。

2、加入包被液，平稳摇动，室温2hr。

3、弃包被液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次。

4、加入一抗（按合适稀释比例用0.01M PBS稀释，液体必须覆盖膜的全部），4℃ 放置12hr以上。阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与[[实验组]]相同。

5、弃一抗和1%BSA，用0.01M PBS分别洗膜，5min×4次。

6、加入[[辣根]]过氧化物酶[[偶联]]的二抗（按合适稀释比例用0.01M PBS稀释），平稳摇动，室温2hr。

7、弃二抗，用0.01M PBS洗膜，5min×4次。

8、加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。

四、注意事项

1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。

2、显色液必须新鲜配置使用，最后加入H2O2。

3、DAB有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。

[[分类:免疫医学]][[分类:生物学]]

免疫印迹法 - 版本历史

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